استخدام الخلايا السرطانية الثديية الماوس في مختبر الغزو الاختباري كمقياس لسلوك الخلايا الأنكجينية
Summary
يتم استخدام اختبار غزو الخلايا في المختبر لقياس إمكانات الانبثاث السرطاني من خلال قياس الإمكانات الخلوية للغزو والهجرة باستخدام إدراج ثقافة الخلايا التي تحتوي على مصفوفة البروتين. يتم تحدي الخلايا للهجرة من خلال مصفوفة البروتين والغشاء المسامي، نحو جاذبية كيميائية، ومن ثم قياسها كميا عن طريق الفحص المجهري الخفيف.
Abstract
يستخدم فحص الغزو في المختبر مصفوفة غنية بالبروتين في غرفة Boyden لقياس قدرة الخلايا المستزرعة على المرور عبر المصفوفة وغشاء مسامي في عملية مماثلة للخطوات الأولية لورم الخلايا السرطانية. يمكن تغيير الخلايا المختبرة للتعبير الجيني أو معالجتها بمثبطات لاختبار التغيرات في إمكانية الغزو. تختبر هذه التجربة النمط الظاهري العدواني لخلايا الورم الثديي للماوس لاكتشاف وتوصيف الأنكوجينيات المحتملة التي تعزز غزو الخلايا. هذه التقنية، ومع ذلك، يمكن أن تكون متعددة الاستخدامات وتكييفها مع العديد من التطبيقات المختلفة. يمكن إجراء التجربة نفسها في يوم واحد ويتم الحصول على النتائج عن طريق الفحص المجهري الخفيف في أقل من يوم واحد. وتشمل النتائج عدد الخلايا الغازية للمقارنة والتحليل. اختبار الغزو في المختبر هو طريقة سريعة وغير مكلفة وواضحة لتحديد سلوك الخلايا في ثقافة التي يمكن استخدامها كتقييم أولي قبل أكثر مشاركة في الاختبارات الحية.
Introduction
يمكن أن يكون فحص الغزو في المختبر أداة مفيدة عند قياس قدرة الخلية على الهجرة من خلال غشاء مغطى بالبروتين، مماثلة للخطوات الأولى في الانبثاث. ومن السمات الرئيسية للخلايا السرطانية الخبيثة قدرتها على الهجرة من خلال وغزو الأنسجة القريبة. السرطان الذي انتشر أو انتشر يطرح المزيد من التحديات العلاج ولديه معدلات أقل من البقاء على قيد الحياة على المدى الطويل، في حين أن الأورام الموضعية هي أسهل لعلاج ولها معدلات أعلى من البقاء على قيد الحياة على المدى الطويل. من أجل الانتشار ، يجب على الخلايا السرطانية ترك الورم الأساسي والهجرة إلى الدورة الدموية أو الجهاز اللمفاوي ، وهي عملية تتطلب المرور عبر المصفوفة خارج الخلية وغشاء الطابق السفلي1. في العملية التي تسمى الانتقال الظهاري mesenchymal (EMT)، يجب على الخلايا السرطانية كسر اتصالات الخلايا الخلوية، والهجرة باتجاه، وغزو الدم أو الأوعية الليمفاوية القريبة. الخطوات الأولية من هذا التسلسلة الانبثاث هي ذات أهمية كبيرة لأن هذه الخطوات هي ما يمكن أن تجعل السرطان أكثر فتكا. العوامل الوراثية والجينية التي تنطوي عليها الخطوات المبكرة من الانبثاث هي محور كمية كبيرة من البحوث، ولكن هناك حاجة إلى أدوات تجريبية دقيقة وموثوق بها لاختبار هذه الخطوات المبكرة في كل من الجسم الحي والمختبر.
أدوات لقياس التغيرات في هجرة الخلايا مثل التئام الجروح (خدش) الاختبارات أو النمو في بيئات 3D مثل اختبار أجار لينة يمكن أن تعالج جزئيا الحاجة إلى أساليب تجريبية لقياس الخطوات المبكرة من الانبثاث، ولكن الفحص لقياس الغزو هو أكثر تحديا منذ العملية تحدث في الجسم داخل بيئة الورم الدقيقة المعقدة. لأغراض فحص الأدوية أو التعديلات الجينية لتحديد العوامل الهامة في الغزو والانبثاث، وهو نظام يمكن استخدامه في المختبر مع الخلايا المستزرعة وتقليد التحديات التي تواجهها الخلايا النقيلية في الجسم الحي هو اختبار الغزو2، 3. سرطان الثدي هو النوع الأكثر شيوعا تشخيص السرطان في النساء والسبب الرئيسي الثاني للوفاة بالسرطان في النساء، لذلك فهم الجينات المسؤولة عن غزو خلايا سرطان الثدي وورم خبيث أمر بالغ الأهمية للصحة العامة. وعلاوة على ذلك، خلايا الماوس هي نظام نموذج مفيد لدراسة سرطان الثدي وتطوره.
ويستند في المختبر في غزو الاختبار على الجمعية غرفة بويدن حيث يتم فصل غرفتين من وسائل الإعلام النمو بواسطة غشاء مسامية3. لتقليد البيئة الدقيقة الورم، يتم تضمين هلام غنية بالبروتين أيضا لفصل الخلايا في غرفة واحدة من chemoattractant في الآخر، والعمل كحاجز غشاء الطابق السفلي. من أجل الهجرة نحو chemoattractant ، يجب أن تمر الخلايا أولا من خلال الحاجز الغني بالبروتين ثم تمر عبر الغشاء المسامي – وهي عملية مماثلة لكيفية هجرة الخلايا النقيلية من خلال ستروما. يمكن تغيير الجل الغني بالبروتين بناء على احتياجات التجربة، ولكن عادة ما يتكون من الكولاجين، أو استخراج غشاء الطابق السفلي (على سبيل المثال، Matrigel)4. وهو خليط معقد من البروتينات، بروتيوغليكانس وعوامل النمو، ولكن في الغالب يتكون من اللامينين والكولاجين الرابع 4،5. ثم يجب أن تمر الخلايا من خلال غشاء مسامية مصنوعة عادة من البولي كربونات، والبوليستر، أو البولي تترافلوروإيثيلين (PTFE). يمكن شراء الأغشية تجاريا ً مع أو بدون جل بروتين (الكولاجين عادةً)، أو قد يتم شراء الجل بشكل منفصل وإضافته. يمكن تعديل حجم المسام على أساس حجم الخلية. في حين تتوفر أحجام المسام من 0.4 – 8.0 ميكرومتر، المسام فقط من 3.0 – 8.0 ميكرومتر كبيرة بما يكفي لهجرة الخلايا. وقد استخدم تقييم الغزو لتحديد فعالية مثبطات على قدرة الخلايا على الهجرة والغزو. في حين تفتقر إلى البيئة الدقيقة الورم الدقيق الموجود في الجسم الحي، فإن اختبار الغزو في المختبر مفيد في فحص العديد من الحالات في وقت قصير مع التقليل من الحاجة إلى نماذج حيوانية. والهدف من هذه التجارب هو مقارنة التعبير الجيني للمشتبه في أنه من الجينات وتحديد الآثار على سلوك الخلايا السرطانية وعدوانية المرض باستخدام اختبار الغزو في المختبر وغيرها من الاختبارات. وبشكل عام، يوفر اختبار الغزو نتائج متسقة وكمية وسريعة لتحديد الإمكانات النقيلية مع كونه أيضاً طريقة غير مكلفة نسبياً ومباشرة وقابلة للتكيف.
Protocol
Representative Results
Discussion
اختبار الغزو في المختبر هو طريقة غير مكلفة وسريعة وكمية ومباشرة لدراسة العوامل التي تشجع غزو الخلايا السرطانية. سرطان الثدي هو السرطان الأكثر شيوعا تشخيص بين النساء. من بين الأنواع الفرعية الرئيسية الثلاثة لسرطان الثدي، السلبية الثلاثية، (أو ER-، PR-، HER2 /neu-)، هو الأكثر عدوانية، والأكث?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد تم دعم هذا العمل بمنحة R15CA169978 من المعاهد الوطنية للصحة. وجاء تمويل إضافي من جامعة فيلانوفا.
Materials
| 24-well plates | Corning | 353504 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | ThermoFisher | 15240062 | |
| BALB/c mice | |||
| Cell Culture Incubator | |||
| Cell Culture Treated Flasks | |||
| Clinical cenrifuge | |||
| Cotton swab | Puritan | 25-806 | |
| Crystal Violet | Sigma Aldrich | C0775 | |
| Distilled water | |||
| DMEM | ThermoFisher | 10566-016 | high glucose, GlutaMAX |
| Ethanol | |||
| FBS | Sigma Aldrich | F2442-500ML | |
| Forcepts | |||
| Glass Slide | VWR | 16004-422 | |
| HBSS | ThermoFisher | 14025076 | no calcium, no magnesium |
| Hemocytometer | |||
| Imersion oil | |||
| Invasion Chambers (24-well) | Corning | 354480 | Cat. #354481 for 6-well |
| Light Microscope | |||
| Lipofectamine Transfection Reagent | |||
| paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148 | |
| PBS | |||
| Scalpel, disposable | #11 | ||
| shRNA | |||
| Sterile Transfer pipet | |||
| Trypsin-EDTA | ThermoFisher | 25200056 |
References
- He, X., Lee, B., Jiang, Y. Cell-ECM Interactions in Tumor Invasion. Advances in Experimental Medicine and Biology. 936, 73-91 (2016).
- Albini, A., et al. A rapid in vitro assay for quantitating the invasive potential of tumor cells. Recherche en cancérologie. 47 (12), 3239-3245 (1987).
- Simon, N., Noel, A., Foidart, J. M. Evaluation of in vitro reconstituted basement membrane assay to assess the invasiveness of tumor cells. Invasion and Metastasis. 12 (3-4), 156-167 (1992).
- Benton, G., Arnaoutova, I., George, J., Kleinman, H. K., Koblinski, J. Matrigel: from discovery and ECM mimicry to assays and models for cancer research. Advanced Drug Delivery Reviews. 79-80, 3-18 (2014).
- Kleinman, H. K., Martin, G. R. Matrigel: basement membrane matrix with biological activity. Seminars in Cancer Biology. 15 (5), 378-386 (2005).
- Kang, J. J., Schwegel, T., Knepper, J. E. Sequence similarity between the long terminal repeat coding regions of mammary-tumorigenic BALB/cV and renal-tumorigenic C3H-K strains of mouse mammary tumor virus. Virology. 196 (1), 303-308 (1993).
- Slagle, B. L., Lanford, R. E., Medina, D., Butel, J. S. Expression of mammary tumor virus proteins in preneoplastic outgrowth lines and mammary tumors of BALB/cV mice. Recherche en cancérologie. 44 (5), 2155-2162 (1984).
- Schmidt, J. A., et al. Regulation of the oncogenic phenotype by the nuclear body protein ZC3H8. BMC Cancer. 18 (1), 759 (2018).
- Neophytou, C., Boutsikos, P., Papageorgis, P. Molecular Mechanisms and Emerging Therapeutic Targets of Triple-Negative Breast Cancer Metastasis. Frontiers in Oncology. 8, 31 (2018).
- Al-Alwan, M., et al. Fascin is a key regulator of breast cancer invasion that acts via the modification of metastasis-associated molecules. PloS One. 6 (11), e27339 (2011).
- Wang, M. J., Zhang, H., Li, J., Zhao, H. D. microRNA-98 inhibits the proliferation, invasion, migration and promotes apoptosis of breast cancer cells by binding to HMGA2. Bioscience Reports. 38 (5), (2018).
- Zheng, Y. F., Luo, J., Gan, G. L., Li, W. Overexpression of microRNA-98 inhibits cell proliferation and promotes cell apoptosis via claudin-1 in human colorectal carcinoma. Journal of Cellular Biochemistry. 120 (4), 6090-6105 (2019).
- Yan, W., Cao, Q. J., Arenas, R. B., Bentley, B., Shao, R. GATA3 inhibits breast cancer metastasis through the reversal of epithelial-mesenchymal transition. Journal of Biological Chemistry. 285 (18), 14042-14051 (2010).
