腫瘍性細胞行動の尺度としてのインビトロ侵血アッセイにおけるマウス乳腺腫瘍細胞の使用
Summary
インビトロ細胞侵入アッセイは、タンパク質マトリックスを含む細胞培養インサートを用いて細胞侵入および移動の細胞電位を定量化することにより、癌転移の可能性を測定するために使用される。細胞は、タンパク質マトリックスと多孔質膜を通って、化学集化剤に向かって移動し、光顕微鏡で定量化することに挑戦される。
Abstract
インビトロ侵食アッセイは、ボイデン室のタンパク質が豊富なマトリックスを使用して、培養細胞がマトリックスを通過する能力と多孔質膜を癌細胞転移の初期段階に類似したプロセスで測定します。試験された細胞は、遺伝子発現のために変更したり、インヒビターで処理して侵入電位の変化をテストすることができます。この実験は、マウス乳腺腫瘍細胞の積極的な表現型をテストし、細胞侵入を促進する潜在的な腫瘍遺伝子を発見し、特徴付ける。しかし、この技術は汎用性が高く、多くの異なるアプリケーションに適応できます。実験自体は1日で行うことができ、結果は1日未満で光顕微鏡検査によって取得されます。結果には、比較および分析のための侵入細胞の数が含まれます。インビトロ侵血アッセイは、生体内アッセイに関与する前に初期評価として使用できる培養中の細胞挙動を決定するための迅速で安価で明確な方法です。
Introduction
インビトロ侵血アッセイは、転移の最初のステップに類似したタンパク質被覆膜を通って移動する細胞の能力を測定する際に有用なツールでありうる。悪性癌細胞の重要な特徴は、近くの組織を介して移動し、侵入する能力です。転移または転移した癌は、より多くの治療上の課題を提起し、長期生存率が低い一方で、局所的な腫瘍は治療が容易であり、長期生存率が高い。転移するためには、癌細胞は原発腫瘍を残して循環器系またはリンパ系に移行しなければならず、細胞外マトリックスおよび地下膜1を通過する必要があるプロセスである。上皮間葉転移(EMT)と呼ばれるプロセスでは、腫瘍細胞は細胞間接触を破り、方向に移動し、近くの血液またはリンパ管に侵入しなければならない。この転移カスケードの最初のステップは、これらのステップが癌を死語させることができるものであるので、大きな関心があります。転移の初期段階に関与する遺伝的およびエピジェネティックな要因は、多くの研究の焦点ですが、インビボとインビトロの両方でこれらの初期のステップをテストするには、正確で信頼性の高い実験ツールが必要です。
創傷治癒(スクラッチ)アッセイやソフト寒天アッセイなどの3D環境での増殖などの細胞移動の変化を測定するツールは、部分的に転移の初期段階を測定する実験的方法の必要性に対処することができますが、侵入を測定するためのアッセイは、プロセスは複雑な腫瘍微小環境内で体内で起こるので、より困難です。薬物や遺伝子改変をスクリーニングして侵入および転移の重要な因子を決定する目的で、培養細胞をインビトロで使用し、生体内の転移細胞が直面する課題を模倣することができるシステムが侵襲アッセイ2、 3.乳癌は女性で最も一般的に診断されたタイプの癌であり、女性の癌死の第二の主要な原因であり、乳癌細胞の侵入と転移の原因となる遺伝子を理解することは公衆衛生にとって非常に重要です。さらに、マウス細胞は、乳癌とその進行を研究するための有用なモデルシステムである。
インビトロ侵略アッセイは、成長培地の2つのチャンバーが多孔質膜3によって分離されているボイデン室アセンブリに基づいています。腫瘍微小環境を模倣するために、タンパク質が豊富なゲルは、一方のチャンバー内の細胞を他方の化学刺激剤から分離し、基体膜バリアとして作用するようにも含まれる。化学集化剤に向かって移行するためには、細胞はまずタンパク質が豊富な障壁を通過し、次に多孔質膜を通過する必要があります。タンパク質が豊富なゲルは、実験のニーズに基づいて変更することができるが、通常、コラーゲン、または基基膜抽出物(例えば、Matrigel)4から構成される。これは、タンパク質、プロテオグリカンおよび成長因子の複雑な混合物であるが、主にラミニンとコラーゲンIV 4、5で構成されている。細胞は、典型的にはポリカーボネート、ポリエステル、またはポリテトラフルオロエチレン(PTFE)で作られた多孔質膜を通過する必要があります。膜は、タンパク質ゲル(典型的にはコラーゲン)の有無にかかわらず商業的に購入されてもよいし、またはゲルを別途購入して添加してもよい。細孔のサイズは細胞のサイズに基づいて調節することができる。細孔サイズは0.4~8.0 μmで利用可能ですが、3.0~8.0 μmの細孔のみが細胞移動に十分な大きさです。侵襲アッセイは、細胞が移動して侵入する能力に対する阻害剤の有効性を決定するために使用されてきた。インビボに存在する正確な腫瘍微小環境を欠いている間、インビトロ侵受アッセイは動物モデルの必要性を最小にしながら、短時間で多くの条件をスクリーニングする上で有益である。これらの実験の目的は、疑わしい腫瘍遺伝子の遺伝子発現を比較し、インビトロ侵血アッセイおよびその他の試験を用いて癌細胞の挙動および疾患の攻撃性に及ぼす影響を決定することです。全体として、侵受アッセイは、比較的安価で、わかりやすく、適応可能な方法である一方で、転移電位を決定するための一貫性のある定量的かつ迅速な結果を提供します。
Protocol
Representative Results
Discussion
インビトロ侵血アッセイは、癌細胞の侵入を促進する因子を研究するための安価で、迅速、定量的、および簡単な方法である。乳癌は、女性の間で最も一般的に診断された癌です。乳癌の3つの主要なサブタイプのうち、トリプルネガティブ(またはER-、PR-、HER2/neu-)は、最も攻撃的で、転移する可能性が最も高く、最も致命的な9である。したがって、転移をもたらす遺…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、国立衛生研究所の助成金R15CA169978によって支援されました。追加の資金はビジャノバ大学から来ました.
Materials
| 24-well plates | Corning | 353504 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | ThermoFisher | 15240062 | |
| BALB/c mice | |||
| Cell Culture Incubator | |||
| Cell Culture Treated Flasks | |||
| Clinical cenrifuge | |||
| Cotton swab | Puritan | 25-806 | |
| Crystal Violet | Sigma Aldrich | C0775 | |
| Distilled water | |||
| DMEM | ThermoFisher | 10566-016 | high glucose, GlutaMAX |
| Ethanol | |||
| FBS | Sigma Aldrich | F2442-500ML | |
| Forcepts | |||
| Glass Slide | VWR | 16004-422 | |
| HBSS | ThermoFisher | 14025076 | no calcium, no magnesium |
| Hemocytometer | |||
| Imersion oil | |||
| Invasion Chambers (24-well) | Corning | 354480 | Cat. #354481 for 6-well |
| Light Microscope | |||
| Lipofectamine Transfection Reagent | |||
| paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148 | |
| PBS | |||
| Scalpel, disposable | #11 | ||
| shRNA | |||
| Sterile Transfer pipet | |||
| Trypsin-EDTA | ThermoFisher | 25200056 |
References
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