L'uso di cellule tumorali mammarie del topo in un saggio di invasione in vitro come misura del comportamento cellulare oncogeno
Summary
Il saggio di invasione delle cellule in vitro viene utilizzato per misurare il potenziale della metastasi del cancro quantificando il potenziale cellulare per l’invasione e la migrazione utilizzando inserti di coltura cellulare contenenti matrice proteica. Si sfida nommossa alle cellule di migrare attraverso la matrice proteica e una membrana porosa, verso un chemioattraente, e poi quantificate mediante microscopia leggera.
Abstract
Il saggio di invasione in vitro utilizza una matrice ricca di proteine in una camera di Boyden per misurare la capacità delle cellule coltivate di passare attraverso la matrice e una membrana porosa in un processo analogo alle fasi iniziali della metastasi delle cellule tumorali. Le cellule testate possono essere modificate per l’espressione genica o trattate con inibitori per testare i cambiamenti nel potenziale di invasione. Questo esperimento testa il fenotipo aggressivo delle cellule tumorali mammarie dei topi per scoprire e caratterizzare i potenziali oncogeni che promuovono l’invasione cellulare. Questa tecnica, tuttavia, può essere versatile e adattata a molte applicazioni diverse. L’esperimento stesso può essere fatto in un giorno e i risultati vengono acquisiti dalla microscopia leggera in meno di un giorno. I risultati includono i conteggi del numero di celle invasori per il confronto e l’analisi. Il test di invasione in vitro è un metodo rapido, economico e chiaro per determinare il comportamento cellulare in una coltura che può essere utilizzata come valutazione iniziale prima di ulteriori sottovalutazioni di analisi in vivo.
Introduction
Il saggio di invasione in vitro può essere uno strumento utile quando si misura la capacità di una cellula di migrare attraverso una membrana rivestita di proteine, analoga ai primi passi nella metastasi. Una caratteristica chiave delle cellule tumorali maligne è la loro capacità di migrare attraverso e invadere i tessuti vicini. Il cancro che si è diffuso o metastatizzato pone più sfide di trattamento e ha tassi più bassi di sopravvivenza a lungo termine, mentre i tumori localizzati sono più facili da trattare e hanno tassi più elevati di sopravvivenza a lungo termine. Per metastatizzare, le cellule tumorali devono lasciare il tumore primario e migrare nel sistema circolatorio o linfatico, un processo che richiede il passaggio attraverso la matrice extracellulare e la membrana seminterrato1. Nel processo chiamato transizione epiteliale mesenchymal (EMT), le cellule tumorali devono rompere i contatti delle cellule cellulari, migrare direzionalmente e invadere i vasi sanguigni o linfatici vicini. I primi passi di questa cascata di metastasi sono di grande interesse poiché questi passaggi sono ciò che può rendere il cancro più letale. I fattori genetici ed epigenetici coinvolti nelle prime fasi della metastasi sono al centro di una grande quantità di ricerca, ma sono necessari strumenti sperimentali accurati e affidabili per testare questi primi passi sia in vivo che in vitro.
Gli strumenti per misurare i cambiamenti nella migrazione cellulare come i saggi di guarigione delle ferite (graffio) o la crescita in ambienti 3D come i test di agar morbido possono affrontare parzialmente la necessità di metodi sperimentali per misurare i primi passi della metastasi, ma un saggio per misurare l’invasione è più impegnativo dal momento che il processo si verifica nel corpo all’interno di un complesso microambiente tumorale. Ai fini dello screening di farmaci o alterazioni genetiche per determinare fattori importanti nell’invasione e nella metastasi, un sistema che può essere utilizzato in vitro con cellule coltivate e imitare le sfide affrontate dalle cellule metastatiche in vivo è il saggio di invasione2, 3. Il cancro al seno è il tipo di cancro più comunemente diagnosticato nelle donne e la seconda causa di morte per cancro nelle donne, quindi comprendere i geni responsabili dell’invasione delle cellule tumorali e delle metastasi è di fondamentale importanza per la salute pubblica. Inoltre, le cellule del topo sono un utile sistema modello per studiare il cancro al seno e la sua progressione.
Il saggio di invasione in vitro si basa sull’assemblea della Camera di Boyden, dove due camere di mezzo di crescita sono separate da una membrana porosa3. Per imitare il microambiente tumorale, un gel ricco di proteine è incluso anche per separare le cellule in una camera da un chemioattraente nell’altra e agire come una barriera di membrana seminterrato. Per migrare verso il chemioattraente, le cellule devono prima passare attraverso la barriera ricca di proteine e poi passare attraverso la membrana porosa – un processo analogo a come le cellule metastatiche migrano attraverso lo stroma. Il gel ricco di proteine può essere modificato in base alle esigenze dell’esperimento, ma di solito è costituito da collagene, o estratto di membrana seminterrato (ad esempio, Matrigel)4. È una complessa miscela di proteine, proteoglicani e fattori di crescita, ma per lo più è costituito da laminoine e collagene IV 4,5. Le cellule devono quindi passare attraverso una membrana porosa tipicamente in policarbonato, poliestere o politetrafluoroetilene (PTFE). Le membrane possono essere acquistate commercialmente con o senza un gel proteico (tipicamente collagene), oppure il gel può essere acquistato separatamente e aggiunto. La dimensione del poro può essere regolata in base alle dimensioni della cella. Mentre le dimensioni dei pori sono disponibili da 0,4 – 8,0 m, solo i pori da 3,0 a 8,0 m sono abbastanza grandi per la migrazione cellulare. Il saggio di invasione è stato utilizzato per determinare l’efficacia degli inibitori sulla capacità delle cellule di migrare e invadere. Pur mancando l’esatto microambiente tumorale presente in vivo, il test dell’invasione in vitro è utile per lo screening di molte condizioni in breve tempo riducendo al minimo la necessità di modelli animali. L’obiettivo di questi esperimenti è confrontare l’espressione genica di oncogeni sospetti e determinare gli effetti sul comportamento delle cellule tumorali e sull’aggressività della malattia usando il saggio di invasione in vitro e altri test. Nel complesso, il test di invasione fornisce risultati coerenti, quantitativi e rapidi per determinare il potenziale metastatico, pur essendo un metodo relativamente economico, semplice e adattabile.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il test di invasione in vitro è un metodo economico, rapido, quantitativo e diretto per studiare i fattori che promuovono l’invasione delle cellule tumorali. Il cancro al seno è il cancro più comunemente diagnosticato tra le donne. Dei tre principali sottotipi di cancro al seno, triplo negativo, (o ER-, PR-, HER2/neu-), è il più aggressivo, più probabile che metastatizza, e più mortale9. Pertanto, comprendere i geni e l’espressione che causano la metastasi può aiutare a trovare nu…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto dalla sovvenzione R15CA169978 dei National Institutes of Health. Ulteriori finanziamenti provenivano dall’Università di Villanova.
Materials
| 24-well plates | Corning | 353504 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | ThermoFisher | 15240062 | |
| BALB/c mice | |||
| Cell Culture Incubator | |||
| Cell Culture Treated Flasks | |||
| Clinical cenrifuge | |||
| Cotton swab | Puritan | 25-806 | |
| Crystal Violet | Sigma Aldrich | C0775 | |
| Distilled water | |||
| DMEM | ThermoFisher | 10566-016 | high glucose, GlutaMAX |
| Ethanol | |||
| FBS | Sigma Aldrich | F2442-500ML | |
| Forcepts | |||
| Glass Slide | VWR | 16004-422 | |
| HBSS | ThermoFisher | 14025076 | no calcium, no magnesium |
| Hemocytometer | |||
| Imersion oil | |||
| Invasion Chambers (24-well) | Corning | 354480 | Cat. #354481 for 6-well |
| Light Microscope | |||
| Lipofectamine Transfection Reagent | |||
| paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148 | |
| PBS | |||
| Scalpel, disposable | #11 | ||
| shRNA | |||
| Sterile Transfer pipet | |||
| Trypsin-EDTA | ThermoFisher | 25200056 |
References
- He, X., Lee, B., Jiang, Y. Cell-ECM Interactions in Tumor Invasion. Advances in Experimental Medicine and Biology. 936, 73-91 (2016).
- Albini, A., et al. A rapid in vitro assay for quantitating the invasive potential of tumor cells. Recherche en cancérologie. 47 (12), 3239-3245 (1987).
- Simon, N., Noel, A., Foidart, J. M. Evaluation of in vitro reconstituted basement membrane assay to assess the invasiveness of tumor cells. Invasion and Metastasis. 12 (3-4), 156-167 (1992).
- Benton, G., Arnaoutova, I., George, J., Kleinman, H. K., Koblinski, J. Matrigel: from discovery and ECM mimicry to assays and models for cancer research. Advanced Drug Delivery Reviews. 79-80, 3-18 (2014).
- Kleinman, H. K., Martin, G. R. Matrigel: basement membrane matrix with biological activity. Seminars in Cancer Biology. 15 (5), 378-386 (2005).
- Kang, J. J., Schwegel, T., Knepper, J. E. Sequence similarity between the long terminal repeat coding regions of mammary-tumorigenic BALB/cV and renal-tumorigenic C3H-K strains of mouse mammary tumor virus. Virology. 196 (1), 303-308 (1993).
- Slagle, B. L., Lanford, R. E., Medina, D., Butel, J. S. Expression of mammary tumor virus proteins in preneoplastic outgrowth lines and mammary tumors of BALB/cV mice. Recherche en cancérologie. 44 (5), 2155-2162 (1984).
- Schmidt, J. A., et al. Regulation of the oncogenic phenotype by the nuclear body protein ZC3H8. BMC Cancer. 18 (1), 759 (2018).
- Neophytou, C., Boutsikos, P., Papageorgis, P. Molecular Mechanisms and Emerging Therapeutic Targets of Triple-Negative Breast Cancer Metastasis. Frontiers in Oncology. 8, 31 (2018).
- Al-Alwan, M., et al. Fascin is a key regulator of breast cancer invasion that acts via the modification of metastasis-associated molecules. PloS One. 6 (11), e27339 (2011).
- Wang, M. J., Zhang, H., Li, J., Zhao, H. D. microRNA-98 inhibits the proliferation, invasion, migration and promotes apoptosis of breast cancer cells by binding to HMGA2. Bioscience Reports. 38 (5), (2018).
- Zheng, Y. F., Luo, J., Gan, G. L., Li, W. Overexpression of microRNA-98 inhibits cell proliferation and promotes cell apoptosis via claudin-1 in human colorectal carcinoma. Journal of Cellular Biochemistry. 120 (4), 6090-6105 (2019).
- Yan, W., Cao, Q. J., Arenas, R. B., Bentley, B., Shao, R. GATA3 inhibits breast cancer metastasis through the reversal of epithelial-mesenchymal transition. Journal of Biological Chemistry. 285 (18), 14042-14051 (2010).
