El uso de células tumorales mamarias de ratón en un ensayo de invasión in vitro como medida del comportamiento de las células oncogénicas
Summary
El ensayo de invasión celular in vitro se utiliza para medir el potencial de la metástasis del cáncer mediante la cuantificación del potencial celular de invasión y migración utilizando inserciones de cultivo celular que contienen matriz proteica. Las células tienen el desafío de migrar a través de la matriz proteica y una membrana porosa, hacia un quimioatractor, y luego cuantificadas por microscopía ligera.
Abstract
El ensayo de invasión in vitro utiliza una matriz rica en proteínas en una cámara Boyden para medir la capacidad de las células cultivadas para pasar a través de la matriz y una membrana porosa en un proceso análogo a los pasos iniciales de la metástasis celular cancerosa. Las células probadas pueden ser alteradas para la expresión génica o tratadas con inhibidores para detectar cambios en el potencial de invasión. Este experimento prueba el fenotipo agresivo de las células tumorales mamarias del ratón para descubrir y caracterizar los potenciales oncogenes que promueven la invasión celular. Esta técnica, sin embargo, puede ser versátil y adaptada a muchas aplicaciones diferentes. El experimento en sí se puede hacer en un día y los resultados son adquiridos por microscopía de luz en menos de un día. Los resultados incluyen recuentos del número de células invasoras para la comparación y el análisis. El ensayo de invasión in vitro es un método rápido, económico y claro para determinar el comportamiento celular en un cultivo que se puede utilizar como evaluación inicial antes de involucrarse más en ensayos vivos.
Introduction
El ensayo de invasión in vitro puede ser una herramienta útil al medir la capacidad de una célula para migrar a través de una membrana recubierta de proteínas, análoga a los primeros pasos en metástasis. Una característica clave de las células cancerosas malignas es su capacidad para migrar e invadir los tejidos cercanos. El cáncer que se ha diseminado o hecho metástasis plantea más desafíos para el tratamiento y tiene tasas más bajas de supervivencia a largo plazo, mientras que los tumores localizados son más fáciles de tratar y tienen tasas más altas de supervivencia a largo plazo. Para hacer metástasis, las células cancerosas deben abandonar el tumor primario y migrar al sistema circulatorio o linfático, un proceso que requiere pasar a través de la matriz extracelular y la membrana del sótano1. En el proceso llamado transición mesenquimal epitelial (EMT), las células tumorales deben romper los contactos de las células celulares, migrar direccionalmente e invadir la sangre o los vasos linfáticos cercanos. Los pasos iniciales de esta cascada de metástasis son de gran interés ya que estos pasos son lo que puede hacer que el cáncer sea más mortal. Los factores genéticos y epigenéticos involucrados en los primeros pasos de la metástasis son el foco de una gran cantidad de investigación, pero se necesitan herramientas experimentales precisas y confiables para probar estos primeros pasos tanto in vivo como in vitro.
Las herramientas para medir los cambios en la migración celular, como los ensayos de cicatrización de heridas (rasguños) o el crecimiento en entornos 3D, como los ensayos de agar blandos, pueden abordar parcialmente la necesidad de métodos experimentales para medir los primeros pasos de metástasis, pero un ensayo para medir la invasión es más desafiante ya que el proceso ocurre en el cuerpo dentro de un microambiente tumoral complejo. A los efectos del cribado de fármacos o alteraciones genéticas para determinar factores importantes en la invasión y metástasis, un sistema que puede ser utilizado in vitro con células cultivadas e imitar los desafíos a los que se enfrentan las células metastásicas in vivo es el ensayo de invasión2, 3. El cáncer de mama es el tipo de cáncer diagnosticado con mayor frecuencia en las mujeres y la segunda causa de muerte por cáncer en las mujeres, por lo que comprender los genes responsables de la invasión de células de cáncer de mama y la metástasis es de vital importancia para la salud pública. Además, las células de ratón son un sistema modelo útil para el estudio del cáncer de mama y su progresión.
El ensayo de invasión in vitro se basa en el conjunto de la CámaraBoyden, donde dos cámaras de medios de crecimiento están separadas por una membrana porosa 3. Para imitar el microambiente tumoral, también se incluye un gel rico en proteínas para separar las células en una cámara de un quimioatractor en la otra y actuar como una barrera de membrana del sótano. Con el fin de migrar hacia la quimioattractant, las células primero deben pasar a través de la barrera rica en proteínas y luego pasar a través de la membrana porosa – un proceso análogo a cómo las células metastásicas migran a través del estroma. El gel rico en proteínas puede ser alterado en función de las necesidades del experimento, pero por lo general consiste en colágeno, o extracto de membrana de sótano (por ejemplo, Matrigel)4. Es una mezcla compleja de proteínas, proteoglicanos y factores de crecimiento, pero sobre todo consiste en laminins y colágeno IV 4,5. Las células deben pasar a través de una membrana porosa típicamente hecha de policarbonato, poliéster o politetrafluoroetileno (PTFE). Las membranas se pueden comprar comercialmente con o sin un gel de proteína (normalmente colágenos), o el gel se puede comprar por separado y añadir. El tamaño del poro se puede ajustar en función del tamaño de celda. Mientras que los tamaños de los poros están disponibles de 0,4 a 8,0 m, solo los poros de 3,0 a 8,0 m son lo suficientemente grandes para la migración celular. El ensayo de invasión se ha utilizado para determinar la eficacia de los inhibidores sobre la capacidad de las células para migrar e invadir. Aunque carece del microambiente tumoral exacto que está presente in vivo, el ensayo de invasión in vitro es beneficioso para examinar muchas condiciones en poco tiempo, al tiempo que minimiza la necesidad de modelos animales. El objetivo de estos experimentos es comparar la expresión génica de los oncogenes sospechosos y determinar los efectos sobre el comportamiento de las células cancerosas y la agresividad de las enfermedades utilizando el ensayo de invasión in vitro y otras pruebas. En general, el ensayo de invasión proporciona resultados consistentes, cuantitativos y rápidos para determinar el potencial metastásico, al mismo tiempo que es un método relativamente barato, sencillo y adaptable.
Protocol
Representative Results
Discussion
El ensayo de invasión in vitro es un método económico, rápido, cuantitativo y sencillo para estudiar los factores que promueven la invasión de células cancerosas. El cáncer de mama es el cáncer diagnosticado con mayor frecuencia entre las mujeres. De los tres principales subtipos de cáncer de mama, triple negativo, (o ER-, PR-, HER2/neu-), es el más agresivo, más propenso a metástasis, y más mortal9. Por lo tanto, comprender los genes y la expresión que resultan en metástas…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por la subvención R15CA169978 de los Institutos Nacionales de Salud. La financiación adicional provino de la Universidad de Villanova.
Materials
| 24-well plates | Corning | 353504 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | ThermoFisher | 15240062 | |
| BALB/c mice | |||
| Cell Culture Incubator | |||
| Cell Culture Treated Flasks | |||
| Clinical cenrifuge | |||
| Cotton swab | Puritan | 25-806 | |
| Crystal Violet | Sigma Aldrich | C0775 | |
| Distilled water | |||
| DMEM | ThermoFisher | 10566-016 | high glucose, GlutaMAX |
| Ethanol | |||
| FBS | Sigma Aldrich | F2442-500ML | |
| Forcepts | |||
| Glass Slide | VWR | 16004-422 | |
| HBSS | ThermoFisher | 14025076 | no calcium, no magnesium |
| Hemocytometer | |||
| Imersion oil | |||
| Invasion Chambers (24-well) | Corning | 354480 | Cat. #354481 for 6-well |
| Light Microscope | |||
| Lipofectamine Transfection Reagent | |||
| paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148 | |
| PBS | |||
| Scalpel, disposable | #11 | ||
| shRNA | |||
| Sterile Transfer pipet | |||
| Trypsin-EDTA | ThermoFisher | 25200056 |
References
- He, X., Lee, B., Jiang, Y. Cell-ECM Interactions in Tumor Invasion. Advances in Experimental Medicine and Biology. 936, 73-91 (2016).
- Albini, A., et al. A rapid in vitro assay for quantitating the invasive potential of tumor cells. Recherche en cancérologie. 47 (12), 3239-3245 (1987).
- Simon, N., Noel, A., Foidart, J. M. Evaluation of in vitro reconstituted basement membrane assay to assess the invasiveness of tumor cells. Invasion and Metastasis. 12 (3-4), 156-167 (1992).
- Benton, G., Arnaoutova, I., George, J., Kleinman, H. K., Koblinski, J. Matrigel: from discovery and ECM mimicry to assays and models for cancer research. Advanced Drug Delivery Reviews. 79-80, 3-18 (2014).
- Kleinman, H. K., Martin, G. R. Matrigel: basement membrane matrix with biological activity. Seminars in Cancer Biology. 15 (5), 378-386 (2005).
- Kang, J. J., Schwegel, T., Knepper, J. E. Sequence similarity between the long terminal repeat coding regions of mammary-tumorigenic BALB/cV and renal-tumorigenic C3H-K strains of mouse mammary tumor virus. Virology. 196 (1), 303-308 (1993).
- Slagle, B. L., Lanford, R. E., Medina, D., Butel, J. S. Expression of mammary tumor virus proteins in preneoplastic outgrowth lines and mammary tumors of BALB/cV mice. Recherche en cancérologie. 44 (5), 2155-2162 (1984).
- Schmidt, J. A., et al. Regulation of the oncogenic phenotype by the nuclear body protein ZC3H8. BMC Cancer. 18 (1), 759 (2018).
- Neophytou, C., Boutsikos, P., Papageorgis, P. Molecular Mechanisms and Emerging Therapeutic Targets of Triple-Negative Breast Cancer Metastasis. Frontiers in Oncology. 8, 31 (2018).
- Al-Alwan, M., et al. Fascin is a key regulator of breast cancer invasion that acts via the modification of metastasis-associated molecules. PloS One. 6 (11), e27339 (2011).
- Wang, M. J., Zhang, H., Li, J., Zhao, H. D. microRNA-98 inhibits the proliferation, invasion, migration and promotes apoptosis of breast cancer cells by binding to HMGA2. Bioscience Reports. 38 (5), (2018).
- Zheng, Y. F., Luo, J., Gan, G. L., Li, W. Overexpression of microRNA-98 inhibits cell proliferation and promotes cell apoptosis via claudin-1 in human colorectal carcinoma. Journal of Cellular Biochemistry. 120 (4), 6090-6105 (2019).
- Yan, W., Cao, Q. J., Arenas, R. B., Bentley, B., Shao, R. GATA3 inhibits breast cancer metastasis through the reversal of epithelial-mesenchymal transition. Journal of Biological Chemistry. 285 (18), 14042-14051 (2010).
