Summary
Burada, kütle spektrometresi için numunelerin hazırlanması için bir on-membran sindirim tekniği için bir protokol sunuyoruz. Bu teknik, protein-protein etkileşimlerinin uygun analizini kolaylaştırır.
Abstract
Çok sayıda hücre içi proteinler, hücre içi ve hücre dışı koşullara uygun olarak fiziksel olarak etkileşime girebilir. Nitekim, hücresel fonksiyonlar büyük ölçüde hücre içi protein-protein etkileşimleri bağlıdır. Bu nedenle, bu etkileşimler hakkında araştırma fizyolojik süreçlerin anlaşılması kolaylaştırılması için vazgeçilmez. İlişkili proteinlerin ortak yağış, ardından kütle spektrometresi (MS) analizi, yeni protein etkileşimlerini tanımlamanıza olanak sağlar. Bu çalışmada, protein-protein etkileşimlerinin analizinde membran sindirimi ile birlikte immünopetoziteksiyon-sıvı kromatografi (LC)-MS/MS analizinin yeni tekniğinin ayrıntılarını sağdık. Bu teknik, ham immünopantitants için uygundur ve proteomik analizlerin verimi artırabilir. Etiketlenmiş rekombinant proteinler belirli antikorlar kullanılarak çöktürülmüş; Sonraki, Poliviniliden difluorid membran parçaları üzerine şişkinlik immünoprecipitants redüktif alkilasyon maruz kalmıştır. Tripsinizasyon sonrasında, sindirilmiş protein kalıntıları LC-MS/MS kullanılarak incelenmiştir. bu tekniği kullanarak, birkaç aday ilişkili proteini tespit edebildik. Böylece, bu yöntem uygun ve yeni protein-protein etkileşimleri karakterizasyonu için yararlıdır.
Introduction
Proteinler yaşayan organizmalarda kurucu roller oynamakla birlikte, hücre içi ortamlarda sürekli sentezlenmiş, işlenir ve bozulur. Ayrıca, hücre içi proteinler sıklıkla fiziksel ve biyokimyasal olarak etkileşime girebilir, bu da1,2,3' ün fonksiyonunu etkiler. Örneğin, spliceosome ile ilişkili protein homolog CWC22 ökaryotik çeviri başlatma faktörü 4A3 (eIF4A3) ile doğrudan bağlama, eXoN Junction Complex4' ün montajı için gereklidir. Bu ile tutarlı, CWC22 için benzeşimi bulunmayan bir eIF4A3 mutant eXoN kavşak karmaşık güdümlü mRNA yapıştırma4kolaylaştırmak için başarısız olur. Böylece, protein etkileşimlerinin incelenmesi, fizyolojik düzenlemenin yanı sıra hücresel fonksiyonların kesin anlayışı için çok önemlidir.
Kütle spektrometresi (MS) ' deki son gelişmeler protein-protein etkileşimlerinin kapsamlı analizine uygulanmıştır. Örneğin, endojen proteinlerin Co-yağış veya exogenously ilişkili proteinleri ile etiketlenmiş proteinleri tanıttı, MS Analizi tarafından izlenen, yeni protein etkileşimleri belirlenmesi sağlar5. Ancak, MS/MS analizinin büyük bir darboğaz protein numunelerinin triptik diyetleri kötü kurtarma olduğunu. Hücre Lysates üzerinde proteomik analizler yapmak için, in-jel ve on-membran sindirim teknikleri genellikle MS/MS örnekleri hazırlamak için kullanılmaktadır. Daha önce bir on-membran sindirim tekniği ile bir in-jel sindirim prosedürü karşılaştırdık6, ve ikinci daha iyi sıra kapsamı ile ilişkili olduğunu gösterdi. Polyvinylidene difluorid (PVDF) membran bu amaçla uygun olabilir, çünkü mekanik olarak sağlam ve yüksek konsantrasyonlarda organik çözücüler için dayanıklı7,8, immobilize enzimatik sindirim izin % 80 Asetonitril9varlığında proteinler. Ayrıca, bir membran üzerinde immobilizasyon hedef proteinlerde Konformasyonel değişiklikleri neden olabilir, triptic sindirim verimliliği iyileştirmeler yol10. Buna göre, bu yazıda, bir on-membran sindirim tekniği kullanılarak protein etkileşimlerinin ımantioprecipitation-LC/MS/MS analizinin kullanımını tarif ettik. Bu basit yöntem, uzman olmayan laboratuvarlarda bile protein-protein etkileşimlerinin uygun analizini kolaylaştırır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. immünopaperasyonu
Not: aşağıdaki bölümlerde açıklandığı gibi, sodyum olmayan dodecil sülfat (SDS) liziz tamponu ve sitrat elüsyonu kullandık. Ancak, alternatif olarak ev içi immünopresipitasyon tekniğinin kullanımı da LC-MS/MS örnekleri hazırlamak için uygulanabilir.
- Bir epitopu etiketi tek başına veya bir füzyon proteini kodlama vektörler ile kültürsüz hücreler transfect. Temsili veri edinme için, J774 hücrelerini (1 x 106) vektörler ile yeşil floresan proteini (Gfp) tek başına veya Gfp-Fused Capn6 (calpain-6 gen) cationıc lipozomları kullanarak aktarabilir.
- Manyetik boncuklar için antikor Konjugat.
- Bu amaçla, 500 μL sitrat fosfat tamponunun (24,5 mM sitrik asit, 51,7 mM ditemel sodyum fosfat; pH 5,0) bir 1,5 mL test tüpünde manyetik boncuk (25 μL/reaksiyon) ile Anti-GFP antikor (2 μL/reaksiyon) karıştırın.
- 1 saat oda sıcaklığında 50 RPM 'de karışımı döndürün. Sonra, IgG-konjugasyonlu boncukları üç kez sitrat fosfat tampon ile yıkayın 0,1% Polyoxyethylene (20) Sorbitan monolaurate.
- Uygun bir liziz tamponu kullanarak nakil hücreleri Lyse. Temsilci veri edinme için, 400 μL lizis tampon (50 mm Tris-HCL) içinde buz üzerinde 30 dk nakli hücreler Lyse; pH 7,5, 120 mm NaCl, 0,5% Poly (oxyethelene) octylphenyl eter) içeren 40 μmol/L fenilmetilsülfonil fluorid, 50 μg/ml leupeptin, 50 μg/ mL Aprotinin, 200 μmol/L sodyum ortoovanadat, ve 1 mM etilen glikol tetraasetik asit (EGTA) içinde 1,5 mL test tüpleri 24 saat transfeksiyondan sonra.
- 5 dakika 15.000 x g santrifügleme ile lysate temizleyin ve supernatant toplamak.
- Lysate precleer. 1,5 mL-test tüpünde etiketli olmayan manyetik boncuk (25 μL/reaksiyon) ekleyin. 500 μL sitrat fosfat tampon ile boncukları üç kez yıkayın. Son yıkama sitrat fosfat tampon kaldırıldıktan sonra, manyetik boncuk üzerinde hücre lysate ekleyin. 50 RPM 'de Rotator kullanarak karışımı, oda sıcaklığında 30 dakika boyunca döndürün.
- Manyetik ayırıcı için 5 dakika boyunca test tüpünü manyetik stand üzerine yerleştirin ve hücre lysate 'i toplayın. Üretici tarafından belirlenmiş manyetik stand kullanımı tavsiye edilir.
- Hedef proteinleri konjugasyonlu boncuklarla bağlar. Immunoglobulin (Ig) G-konjuge boncukları manyetik ayırma için 5 dakika boyunca manyetik stand üzerine yerleştirin, sitrat tamponunu atın ve sonra hücre lysate 'yi Ayrı boncuklarla ekleyin.
- 1 saat oda sıcaklığında 50 RPM 'de karışımı döndürün.
- Hedef proteinleri serbest hedef olmayan proteinlerden ayırın. 500 μL kullanarak boncukları üç kez yıkayın 0,1% Polyoxyethylene içeren sitrat fosfat tampon (20) Sorbitan monolaurat. Son yıkamadan sonra, 30 μL sitrat tamponu (pH 2 – 3) ekleyin ve hedef proteinlere elute etmek için oda sıcaklığında 5 dakika boyunca inküye yapın.
Not: immünopresipitasyon kurtarma yetersiz ise, flag veya It gibi alternatif epitopu etiketleri kullanımı, verimliliği artırabilir. Elüsyonun verimliliği yetersiz ise, SDS tabanlı bir çözüm gibi diğer eluants kullanımı verimliliği artırabilir.
2. proteinler üzerinde membran sindirim
Not: eksojen proteinlerle kontaminasyonu önlemek için protein içermeyen malzeme ve ekipmanların kullanılması gereklidir. Ayrıca, operatörün insan proteinlerinin kontaminasyonunu önlemek için cerrahi maske ve eldiven takması önerilir.
- PVDF membranlarını, metanol ile silinmiş ve kullanmadan hemen önce kurutulmuş cerrahi makas kullanarak 3 mm x 3 mm 'lik parçalara ayırın.
- Temiz alüminyum folyo üzerinde PVDF membran parçaları üzerinde 2 – 5 μL etanol ekleyin.
- Tamamen kurumadan önce, hidrofilik PVDF membranlarına (numune başına 2 – 5 μL, 4 – 6 adet) eluant ekleyin ve membran yüzeyi mat olana kadar membranları hava kurutun. Kurutulmuş membranlar 4 °C ' de saklanabilir.
- Tüm membranları 1,5 mL plastik tüplere aktarın, membranları hidrofilik yapmak için 20 – 30 μL etanol ekleyin ve sonra bir pipet kullanarak etanol çıkarın.
- Membran tamamen kurmadan önce, 200 μL ditiyotreitol (DTT) tabanlı reaksiyon çözeltisi (80 mm NH4HCO3, 10 mm DTT ve% 20 acetonitrile) ekleyin ve 1 h için 56 °c ' de inküye yapın.
- Reaksiyon solüsyonu 300 μL iodoacetamid çözeltisi ile değiştirin (80 mM NH4HCO3, 55 mm iodoacetamid, ve 20% Asetonitril), ve karanlıkta oda sıcaklığında 45 dk için inküye.
- Membranları iki kez 1 ml distile su ile yıkayın ve bir kez 1 ml% 2 Asetonitril Vortex karıştırma tarafından > 10 s.
- Liyofilize MS-Grade tripsin (malzeme tablosu) doğrudan reaksiyon çözeltisi (30 mm NH4HCO3 içeren% 70 acetonitrile) çözülür. 1 μg tripsin (malzeme tablosu) (30 mm NH4hco3 içeren 70% acetonitrile) Içeren reaksiyon çözeltisi 100 μl ekleyin ve bir gecede 37 °c ' de inküye yapın.
- Triptik kazılar içeren reaksiyon çözümünü bir pipet kullanarak temiz 1,5 mL test tüpüne aktarın.
- Membran için 100 μL yıkama çözeltisi (70% Asetonitril/1% trifluoroasetik asit) ekleyin ve 2 h için 60 °C ' de kulkarın. yıkama çözümünü toplayın ve reaksiyon çözeltisi ile karıştırın. Membran için başka bir 100 μL yıkama solüsyonu ekleyin ve 10 dakika boyunca sonlayın. Sonra yıkama solüsyonu toplayın ve reaksiyon çözeltisi ile karıştırın.
- Laboratuvar filmi bir parça ile test tüpü kapak ve bir iğne ile küçük delikler bir çift olun. Solüsyonu vakum konsantratörü ile kurutun.
- 10 μL% 0,2 formik asit içinde kalıntı çözülür. Santrifüjden sonra (12.000 × g, oda sıcaklığında 3 dk), süpernatant 'ı örnek bir tüpün içine aktarın.
Not: Bu bölümün kritik adımları yıkıyor. On-membran protein sindirimi sırasında, azaltma ve damıtılmış su ile alkilasyon sonra immobilize proteinlerin içeren membranların yıkama, takip 2% Asetonitril, daha fazla için 10 sn, her biri için, reaktiflerin kaldırılması için önemlidir.
3. LC – elektrosprey iyonizasyon (ESı)-MS/MS Analizi
- Bir IR-MS/MS cihazı (malzeme tablosu) bir nano-LC HPLC sistemi (malzeme tablosu) ile birlikte etkinleştirin. Ön sütun (malzeme tablosu) ve analitik sütun (malzeme tablosu) bağlayın.
- Analiz öncesinde, standart peptidler sağlayan 0,2% formik asit içinde çözünmüş Sığır serum albümin triptik yemleri kullanarak kütle spektrometresi kalibre.
- Pozitif iyon modunu ve 400 – 1250 m/z kütle aralığını kullanarak numuneleri analiz edin; sonra 10 MS/MS spektrum (100 ms her) 100 – 1600 m/z Kütle aralığı ve% 2 – 80% Asetonitril ve 0,2% formik asit için 80 dk için bir akış hızında 300 nL/dak.
- İlgili proteinleri tanımlamak için protein tanımlaması (malzeme tablosu) yazılımını kullanarak çıkış verilerini analiz edin. Bir aday protein pozitif tanımlanması için, en az bir yüksek sadakat peptit parçası tespiti (> 95% sadakat) gereklidir.
- Aynı şekilde Gfp ifade endoglikozidazları (tek başına bir Gfp etiketi ifade vektör transfeksiyon) aday proteinleri listesinden çöktürülmüş proteinleri atlayın.
Not: birkaç proteinler veritabanı analizinde tanımlanırsa, MS/MS edinme koşullarının değiştirilmesi (örn., 100 ms 'den her 50 MS 'ye kadar olan süreyi değiştirmek), tanımlanan proteinlerin sayısını artırabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Yukarıda açıklanan prosedür sayesinde, immünopmanitants LC-MS/MS (Şekil 1) kullanılarak analiz edildi. Exojen türev proteinlerin (diğer türler ve IgG 'Ler) dışlandıktan sonra, calpain-6 ' d a ilişkili immünopmasitantlar (Tablo 1) ve Gfp ile ilişkili immünopoitantlara 15 proteinler tespit edildi ( Tablo 2). Calpain-6 ve GFP ilişkili proteinlerin, 11 ' i her iki immünopabitantında da tespit edildi (Şekil 2). Bir kez bu ve calpain-6 kendisi dışlandı, beş aday calpain-6 ilişkili proteinler kaldı: tamamlayıcı C1q alt bileşeni altbirim C, Keratin tip II sitlod 8, IgE-bağlayıcı protein, ADP/ATP translokaz 1, ve Ubiquitin.
Şekil 1 ' de. Membran sindirim tekniği için Düzen
Hücre endoglikozidazları belirli antikorlar ile konjuite manyetik boncuklar kullanılarak çöktürülmüş. İmmunooprecipitation gelen eluant PVDF membran parçaları üzerine şişlenmiş oldu. Daha sonra membranlar, redüktif alkilasyon için reaktiflerle tedavi edildi ve sonra tripsin ile inküpledi. Reaksiyon çözeltisi daha sonra LC-MS/MS kullanılarak analiz edildi. Bu rakam daha büyük bir sürümünü görüntülemek Için lütfen buraya tıklayın .
Şekil 2. Temsili verilere genel bakış
On yedi protein calpain-6 ilişkili immunoprecipitant ve 15 protein GFP ilişkili immünoprecipitant tespit edildi tespit edildi. Bunların her ikisinde de 11 protein saptanmıştır. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
| Adı | Katılım | Peptidler (% 95) | % COV |
| Actin, sitoplazmik 2 | SP | P63260 | ACTG | 5 | 18,4 |
| Actin, aort pürüzsüz Kas | SP | P62737 | Acta | 5 | 18,57 |
| Actin, sitoplazmik 1 | SP | P60710 | AKB | 5 | 18,41 |
| Actin, Alfa iskelet kası | SP | P68134 | Davranır | 5 | 13,53 |
| Actin, Alfa kardiyak Kas 1 | SP | P68033 | ACTC | 5 | 13,53 |
| Actin, gama-enterik pürüzsüz Kas | SP | P63268 | Acth | 5 | 13,56 |
| Uzama faktörü 1-alfa 1 | SP | P10126 | EF1A1 | 3 | 33,33 |
| Uzama faktörü 1-alfa 2 | SP | P62631 | EF1A2 | 3 | 16,2 |
| Keratin, tip II sitiskeletli 8 | SP | P11679 | K2C8 | 3 | 22,65 |
| Tamamlayıcı C1q alt bileşen altbirim C | SP | Q02105 | C1QC | 2 | 8,94 |
| IgE-bağlayıcı protein | SP | P03975 | IGEB | 2 | 21,72 |
| Calpain-6 | SP | O35646 | CAN6 | 1 | 15,91 |
| ADP/ATP translokaz 2 | SP | P51881 | ADT2 | 1 | 27,52 |
| ADP/ATP translokaz 1 | SP | P48962 | ADT1 | 1 | 19,13 |
| Ubiquitin | SP | P62991 | UBIQ | 1 | 40,79 |
| Runt ile ilgili transkripsiyon faktörü 3 | SP | Q64131 | RUNX3 | 1 | 15,89 |
| Runt ile ilgili transkripsiyon faktörü 3 isoform 2 | SP | Q64131-2 | RUNX3 | 1 | 13 |
| "Peptidler (% 95)" MS/MS verilerinde% 95 > bir sadakat puanı ile tanımlanan peptidler sayısını gösterir. "% COV" tüm peptitlerde tanımlanan amino asit kalıntılarının yüzdesini ifade eder (ile > 95% sadakat) ilgili proteini oluşturan amino asit kalıntılarının toplam sayısına göre. Netlik artırmak için, eksojen proteinler (diğer türler ve IgGs proteinleri), ribozomal proteinler, ve Histonlar gösterilmez. | |||
Tablo 1. Calpain-6-ilişkili proteinler
| Adı | Katılım | Peptidler (% 95) | % COV |
| Uzama faktörü 1-alfa 1 | SP | P10126 | EF1A1 | 3 | 24,24 |
| Uzama faktörü 1-alfa 2 | SP | P62631 | EF1A2 | 3 | 24,41 |
| Actin, Alfa iskelet kası | SP | P68134 | Davranır | 3 | 13,53 |
| Actin, Alfa kardiyak Kas 1 | SP | P68033 | ACTC | 3 | 13,53 |
| Actin, gama-enterik pürüzsüz Kas | SP | P63268 | Acth | 3 | 13,56 |
| Actin, sitoplazmik 2 | SP | P63260 | ACTG | 3 | 13,6 |
| Actin, aort pürüzsüz Kas | SP | P62737 | Acta | 3 | 13,53 |
| Actin, sitoplazmik 1 | SP | P60710 | AKB | 3 | 13,6 |
| ADP/ATP translokaz 2 | SP | P51881 | ADT2 | 2 | 25,5 |
| rRNA 2 '-O-Metiltransferaz fibrillarin | SP | P35550 | FBRL için | 2 | 14,37 |
| İSTİLAHIN | SP | P67778 | PHB | 1 | 9,19 |
| Heterojen nükleer Ribonükleoprotein U | SP | Q8VEK3 | (HNRPU) | 1 | 10,63 |
| Runt ile ilgili transkripsiyon faktörü 3 | SP | Q64131 | RUNX3 | 1 | 39,12 |
| Runt ile ilgili transkripsiyon faktörü 3 isoform 2 | SP | Q64131-2 | RUNX3 | 1 | 26 |
| Uzama faktörü 1-gama | SP | Q9D8N0 | EF1G | 1 | 12,36 |
| "Peptidler (% 95)" MS/MS verilerinde% 95 > bir sadakat puanı ile tanımlanan peptidler sayısını gösterir. "% COV" tüm peptitlerde tanımlanan amino asit kalıntılarının yüzdesini ifade eder (ile > 95% sadakat) ilgili proteini oluşturan amino asit kalıntılarının toplam sayısına göre. Netlik artırmak için, eksojen proteinler (diğer türler ve IgGs proteinleri), ribozomal proteinler, ve Histonlar gösterilmez. | |||
Tablo 2 ' ye. GFP ilişkili proteinler
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Daha önce bir on-membran sindirim tekniği6Ile önceden LC-MS/MS kullanarak okside düşük yoğunluklu lipoprotein apolipoprotein B-100 oksidatif modifikasyonları bir analiz tarif ettik. Bu çalışmada, bu tekniği immünopresipitasyon ile birleştirdik ve birkaç calpain-6-ilişkili protein tespit ettik. Bu roman tekniği, aday ilişkili proteinler için tarama uygun bir yöntem temsil eder. Kalpain-6, protein-protein etkileşimi12,13ile hücresel fonksiyonları değiştirmesi bildirildi kalpain proteolitik ailesinin11 olmayan bir proteolitik üyesidir. Bir on-membran sindirim tekniği kullanarak, daha önce farklı bir MS set-up12istihdam diğer calpain-6 ilişkili proteinleri tespit ettik. Bu nedenle, belirlenen adayların sayısını maksimize etmek için birkaç MS koşullarını test etmenizi öneririz. Aynı nedenden dolayı, kullanılan epitopu etiket, deterjan ve elüsyon çözeltisi türleri gibi immünopresipitasyon koşullarının değerlendirilmesi optimum çıkışlar elde etmek için önemlidir.
Bu çalışmada, her iki calpain-6 ve GFP ilişkili immunoprecipantlar 11 proteinleri tespit ettik. Çakışan proteinlerin çoğunluğu aksinin izottipleridir ve bu proteinlerin ifade seviyeleri çok yüksek olduğu için hücresel protein-protein etkileşimlerinin analizinde aktin sitoiskelet proteinleri ile kontaminasyon yaygındır. Bu adaylar bu nedenle daha fazla analiz ihmal edilmelidir. Buna ek olarak, her iki immünopenzitantte uzama faktörleri tespit edildi. Protein sentezi hızını ve doğruluğu düzenler ve protein-katlama14etkiler, ve bu nedenle, uzama faktörlerinin Co-immünoprecipitation şaşırtıcı değildir. Bu proteinler de daha fazla değerlendirme ihmal edilmelidir.
İmmunoplikantlar doğrudan elüsyon çözeltisi içinde Redüksiyon alkilasyonu ve enzimatik sindirime maruz kalabilmektedir15, ve bu çözelti içinde sindirim YÖNTEMI de MS/MS için numunelerin hazırlanması için uygulanabilir. Ancak, on-membran sindirim kullanımı çözüm sindirim üzerinde önemli avantajları var düşünün. PVDF membran, sonraki redüktif alkilasyon ve enzimatik sindirim için bir iskele olarak hizmet vermektedir, yani bu süreçler için gerekli çözücüler kolayca değiştirilebilir. Sonuç olarak, immunopyemek için çeşitli elüsyon çözeltileri kullanmak mümkündür. Bunun tersi olarak, çözelti içinde sindirim için, bu tür koşullarda proteaz aktivitesi sınırlı olabileceğinden SDS tabanlı veya düşük pH elüsyon çözümlerini kullanmak zor olabilir. Ayrıca, hedef proteinlerin immobilizasyonu daha sonra yıkama prosedürünü kolaylaştırabilir. Bu nedenle, on-membran sindirim MS/MS analizi için immunoprecipitants hazırlanması için son derece uygundur. Bu protokol için sınırlı sayıda proteazın uygun olması gerekebilir. Şimdiye kadar, sadece lysyl-C, tripsin dışında, bildirildi% 80 Asetonitril6,9,10,15varlığında aktif.
On-membran sindirim tekniğimiz, yüksek hassasiyetli algılama limiti olan küçük bir miktarda immünopoitant içinde proteinlerin tanımlanması için uygundur. Ancak, bir hedef protein için algılama verimliliği mevcut miktara bağlıdır unutulmamalıdır. Daha büyük miktarlarda mevcut olan proteinler tercihen algılanır ve MS tarafından algılanan daha küçük miktarlarda mevcut olan diğer proteinlerin önlenmesine neden olabilir. Yine de, normal koşullarda çok sayıda protein LC-MS/MS analizi kullanılarak algılanır ve diğer asmalar, hangi aday proteinlerin uygun biyolojik öneme sahip olduğunu açıklığa kavuşturmak için kullanılmalıdır.
Bu çalışmada, immünopantozların analizi için membran üzerinde sindirim tekniği değerlendirilmiştir. Protein-protein etkileşimlerini analiz etmek için böyle uygun ve kapsamlı bir yöntem, gelecekteki proteomik analizlerin verimi geliştirmek için yaygın olarak uygulanabilir olmalıdır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların ifşa etmesi gereken hiçbir şey yok.
Acknowledgments
Bu çalışmada bilim kakenhi Grant numarası 17K09869 (AM), bilim KAKENHI Grant numarası 15K09418 (TM), tanıtımı için Japonya Derneği tanıtımı için Japonya toplum tarafından kısmen destekleniyordu Kanehara Ichiro tıp bilimi Vakfı bir araştırma hibe ve Suzuken Memorial Vakfı (tüm TM) bir araştırma hibe.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetonitrile | Wako | 014-00386 | |
| Citric acid | Wako | 030-05525 | |
| DiNA | KYA Tech Co. | nanoflow high-performance liquid chromatography | |
| DiNa AI | KYA Tech Co. | nanoflow high-performance liquid chromatography equipped with autosampler | |
| DTT | Nacalai tesque | 14112-94 | |
| Dynabeads protein G | Thermo Fisher Scientific | 10003D | |
| Formic acid | Wako | 066-00461 | |
| HiQ Sil C18W-3 | KYA Tech Co. | E03-100-100 | 0.10mmID * 100mmL |
| Iodoacetamide | Wako | 095-02151 | |
| Lipofectamine 3000 | Thermo Fisher Scientific | L3000008 | |
| Living Colors A.v. Monoclonal Antibody (JL-8) | Clontech | 632380 | |
| NaCl | Wako | 191-01665 | |
| NH4HCO3 | Wako | 018-21742 | |
| Nonidet P-40 | Sigma | N6507 | poly(oxyethelene) octylphenyl ether (n=9) |
| peptide standard | KYA Tech Co. | tBSA-04 | tryptic digests of bovine serum albumin |
| PP vial | KYA Tech Co. | 03100S | plastic sample tube |
| Protease inhibitor cooctail | Sigma | P8465 | |
| ProteinPilot software | Sciex | 5034057 | software for protein identification |
| Sequencing Grade Modified Trypsin | Promega | V5111 | trypsin |
| Sodium orthovanadate | Sigma | S6508 | |
| Sodium phosphate dibasic dihydrate | Sigma | 71643 | |
| TFA | Wako | 206-10731 | |
| trap column | KYA Tech Co. | A03-05-001 | 0.5mmID * 1mmL |
| TripleTOF 5600 system | Sciex | 4466015 | Hybrid quadrupole time-of-flight tandem mass spectrometer |
| Tris | Wako | 207-06275 | |
| Tween-20 | Wako | 160-21211 |
References
- Thommen, M., Holtkamp, W., Rodnina, M. V. Co-translational protein folding: progress and methods. Current Opinion in Structural Biology. 42, 83-89 (2017).
- Miyazaki, T., Miyazaki, A. Defective protein catabolism in atherosclerotic vascular inflammation. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 4, 79 (2017).
- Miyazaki, T., Miyazaki, A. Dysregulation of calpain proteolytic systems underlies degenerative vascular disorders. Journal of Atherosclerosis and Thrombosis. 25 (1), 1-15 (2018).
- Steckelberg, A. L., Boehm, V., Gromadzka, A. M., Gehring, N. H. CWC22 connects pre-mRNA splicing and exon junction complex assembly. Cell Reports. 2 (3), 454-461 (2012).
- Turriziani, B., von Kriegsheim, A., Pennington, S. R. Protein-protein interaction detection via mass spectrometry-based proteomics. Advances in Experimental Medicine and Biology. 919, 383-396 (2016).
- Obama, T., et al. Analysis of modified apolipoprotein B-100 structures formed in oxidized low-density lipoprotein using LC-MS/MS. Proteomics. 7 (13), 2132-2141 (2007).
- Matsudaira, P. Sequence from picomole quantities of proteins electroblotted onto polyvinylidene difluoride membranes. The Journal of Biological Chemistry. 262 (21), 10035-10038 (1987).
- Yamaguchi, M., et al. High-throughput method for N-terminal sequencing of proteins by MALDI mass spectrometry. Analytical Chemistry. 77 (2), 645-651 (2005).
- Iwamatsu, A. S-carboxymethylation of proteins transferred onto polyvinylidene difluoride membranes followed by in situ protease digestion and amino acid microsequencing. Electrophoresis. 13 (3), 142-147 (1992).
- Strader, M. B., Tabb, D. L., Hervey, W. J., Pan, C., Hurst, G. B. Efficient and specific trypsin digestion of microgram to nanogram quantities of proteins in organic-aqueous solvent systems. Analytical Chemistry. 78 (1), 125-134 (2006).
- Miyazaki, T., Miyazaki, A. Emerging roles of calpain proteolytic systems in macrophage cholesterol handling. Cellular and Molecular Life Sciences. 74 (16), 3011-3021 (2017).
- Miyazaki, T., et al. Calpain-6 confers atherogenicity to macrophages by dysregulating pre-mRNA splicing. Journal of Clinical Investigation. 126 (9), 3417-3432 (2016).
- Tonami, K., et al. Calpain-6, a microtubule-stabilizing protein, regulates Rac1 activity and cell motility through interaction with GEF-H1. Journal of Cell Science. 124 (Pt 8), 1214-1223 (2011).
- Rodnina, M. V., Wintermeyer, W. Protein elongation, co-translational folding and targeting. Journal of Molecular Biology. 428 (10 Pt B), 2165-2185 (2016).
- Bunai, K., et al. Proteomic analysis of acrylamide gel separated proteins immobilized on polyvinylidene difluoride membranes following proteolytic digestion in the presence of 80% acetonitrile. Proteomics. 3 (9), 1738-1749 (2003).
