Cirugía de hemisección de la médula espinal torácica y evaluación locomotora de campo abierto en la rata

Summary

La hemisección espinal torácica de rata es un modelo valioso y reproducible de lesión unilateral de la médula espinal para investigar los mecanismos neuronales de la recuperación locomotora y la eficacia del tratamiento. Este artículo incluye una guía detallada paso a paso para realizar el procedimiento de hemisección y evaluar el rendimiento locomotor en una arena de campo abierto.

Abstract

La lesión de la médula espinal (SCI) causa alteraciones en la función motora, sensorial y autonómica por debajo del nivel de la lesión. Los modelos animales experimentales son herramientas valiosas para entender los mecanismos neuronales involucrados en la recuperación locomotora después de SCI y para diseñar terapias para poblaciones clínicas. Hay varios modelos experimentales de SCI incluyendo contusiones, compresión y lesiones de transección que se utilizan en una amplia variedad de especies. Una hemisección implica la transección unilateral de la médula espinal e interrumpe todos los tratados ascendentes y descendentes en un solo lado. La hemisección espinal produce una lesión altamente selectiva y reproducible en comparación con las técnicas de contusión o compresión que es útil para investigar la plasticidad neuronal en vías salvadas y dañadas asociadas con la recuperación funcional. Presentamos un protocolo detallado paso a paso para realizar una hemisección torácica a nivel vertebral T8 en la rata que resulta en una parálisis inicial de la extremidad posterior en el lado de la lesión con recuperación espontánea calificada de la función locomotora en varios Semanas. También proporcionamos un protocolo de puntuación locomotor para evaluar la recuperación funcional en campo abierto. La evaluación locomotora proporciona un perfil de recuperación lineal y se puede realizar tanto antes como repetidamente después de una lesión con el fin de examinar con precisión a los animales en busca de puntos de tiempo adecuados para realizar pruebas conductuales más especializadas. La técnica de hemisección presentada se puede adaptar fácilmente a otros modelos y especies de transección, y la evaluación locomotora se puede utilizar en una variedad de SCI y otros modelos de lesiones para puntuar la función locomotora.

Introduction

La lesión de la médula espinal (SCI) se asocia con alteraciones graves en la función motora, sensorial y autonómica. Los modelos animales experimentales de SCI son herramientas valiosas para comprender los eventos anatómicos y fisiológicos involucrados en la patología del SCI, investigar los mecanismos neuronales en reparación y recuperación, y para detectar la eficacia y seguridad de los potenciales terapéuticos Intervenciones. La rata es la especie más utilizada en la investigación^{DeSC 1}. Los modelos de ratas son de bajo costo, fáciles de reproduciry una gran batería de pruebas de comportamiento están disponibles para evaluar los resultados funcionales 2. A pesar de algunas diferencias en la ubicación del tracto, la médula espinalde la rata comparte funciones sensorimotoras similares en general con mamíferos más grandes, incluyendo primates 3,^4. Las ratas también comparten consecuencias fisiológicas y conductuales análogas a SCI que se relacionan con los seres humanos⁵. Los modelos de primates no humanos y grandes modelos animales pueden proporcionar una aproximación más cercana a la SCI⁶ humana y son esenciales para probar la seguridad y eficacia del tratamiento antes de la experimentación humana, pero se utilizan con menos frecuencia debido al bienestar ético y animal consideraciones, gastos y requisitos reglamentarios⁷.

Los modelos de SCI de transección de ratas se realizan mediante la interrupción dirigida de la médula espinal con una lesión selectiva utilizando un cuchillo de disección o tijeras de iridectomía después de una laminectomía. En comparación con una transección completa, la transección parcial en la rata resulta en una lesión menos grave, un cuidado animal postoperatorio más fácil, una recuperación locomotora espontánea y modelos más de cerca de SCI en humanos que es predominantemente incompleta con tejido que conecta la médula espinal y las estructuras supraespinales⁸. Una hemisección unilateral interrumpe todos los tratados ascendentes y descendentes de un solo lado, y produce déficits locomotoras cuantificables y altamente reproducibles, mejorando la exploración de los mecanismos biológicos subyacentes. La consecuencia funcional más prominente de la hemisección es una parálisis inicial de las extremidades en el mismolado y por debajo del nivel de la lesión con recuperación espontánea calificada de la función locomotora durante varias semanas 9,^{10, 11 , 12}. El modelo de hemisección es particularmente útil para investigar la plasticidad neuronal de los tractoes y circuitos dañados y residuales asociados con la recuperación funcional^{9,11,12, 13,14,15,16,17,18}. Específicamente, la hemisección realizada a nivel torácico, es decir, por encima de los circuitos espinales que controlan la locomoción de las extremidades posteriores, es particularmente útil para investigar cambios en el control locomotor. Dado que existe una relación no lineal entre la gravedad de la lesión y la recuperación locomotora después de SCI^19,las pruebas de comportamiento adecuadas para evaluar los resultados funcionales son primordiales en modelos experimentales.

Una batería completa de pruebas de comportamiento están disponibles para evaluar aspectos específicos de la recuperación locomotora funcional en la rata^2,20. Muchas pruebas de locomotoras no proporcionan medidas confiables temprano después de SCI, ya que las ratas están demasiado discapacitadas para soportar su peso corporal. Una medida de rendimiento locomotor espontáneo que es sensible a los déficits temprano después de la lesión, y no requiere entrenamiento preoperatorio o equipo especializado, es beneficiosa para monitorear la recuperación locomotora para los puntos de tiempo adecuados en los que complementar las pruebas de comportamiento especializadas. La puntuación de evaluación de campo abierto de Martínez¹⁰, desarrollada originalmente para evaluar el rendimiento locomotor después de SCI cervical en la rata, es una puntuación ordinal de 20 puntos que evalúa el rendimiento locomotor global durante la locomoción terrestre espontánea en un campo abierto. La puntuación se lleva a cabo por separado para cada extremidad utilizando una rúbrica que evalúa los parámetros específicos de una serie de medidas locomotoras, incluyendo el movimiento de las extremidades articulares, el soporte de peso, la posición del dígito, las habilidades de escalonamiento, la coordinación de las extremidades anteriores y posteriores, y la cola Posición. La puntuación de evaluación se deriva de la escala de clasificación de campo abierto Basso, Beattie y Bresnahan (BBB) diseñada para evaluar el rendimiento locomotor después de la contusión torácica^21. Está adaptado para evaluar con precisión y fiofaidad la función locomotora de las extremidades anteriores y posteriores, permite una evaluación independiente de los diferentes parámetros de puntuación que no es susceptible con la puntuación jerárquica del BBB, y proporciona una recuperación lineal perfil¹⁰. Además, en comparación con el BBB, la puntuación de evaluación es sensible y fiable en los modelos de lesiones más graves^10,11,20,22. La puntuación de evaluación se ha utilizado para evaluar el deterioro locomotor en la rata después de la cera cervical^10,12 y torácica⁹ SCI solo y en combinación con lesión cerebral traumática²³.

Presentamos aquí un protocolo detallado paso a paso para realizar un Hemisección Torácica SCI a nivel vertebral T8 en la hembra Long-Evans, y para evaluar la recuperación del locomotor de las extremidades posteriores en el campo abierto.

Protocol

Los experimentos descritos en este artículo se realizaron de conformidad con las directrices del Consejo Canadiense de Cuidado de Animales y fueron aprobados por el comité de ética de la Universidad de Montreal. 1. Cirugía de hemisección torácica Use el equipo de protección adecuado (guantes, máscara y bata) para mantener un ambiente aséptico para la cirugía. Limpie el área quirúrgica con toallitas de alcohol y coloque cortinas quirúrgicas estériles sobre el campo quir?…

Representative Results

Las lesiones reproducibles con un alto grado de consistencia se pueden generar con la técnica de hemisección. Para evaluar y comparar el tamaño de las lesiones entre grupos experimentales, el área máxima de la lesión como porcentaje de la sección transversal total de la médula espinal se puede calcular fácilmente con la tinción histológica de las secciones de la médula espinal. La Figura 1 muestra una lesión representativa del hemicord izquierdo y una superposición de la propor…

Discussion

Una de las principales fortalezas de la técnica de hemisección es la selectividad y reproducibilidad de la lesión, lo que reduce la variabilidad en fenotipos histológicos y conductuales entre animales^25. Con el fin de garantizar una lesión unilateral en el nivel espinal adecuado, la identificación precisa tanto del segmento vertebral adecuado como de la línea media de la médula espinal es crítica. Como puede haber una tendencia a que la médula espinal gire en la dirección del corte dura…

Materials

Baytril	CDMV	11242
Blunt dissection scissors	World Precision Instruments	503669
Buprenorphine hydrochoride	CDMV
Camera lens	Pentax	C31204TH	12.5-75mm, f1.8, 2/3" format, C-mount
CMOS video camera	Basler	acA2000-165uc	2/3" format, 2048 x 1088 pixels, up to 165 fps, C-mount, USB3
Compressed oxygen gas	Praxair
Cotton tipped applicators	CDMV	108703
Delicate bone trimmers	Fine Science Tools	16109-14
Dissecting knife	Fine Science Tools	10055-12
Dumont fine forceps (#5)	Fine Science Tools	11254-20
Ethicon Vicryl 4/0 Violet Braided FS-2  suture (J392H)	CDMV	111689
Feedback-controlled heating pad	Harvard Apparatus	55-7020
Female Long-Evans rats	Charles River Laboratories	Strain code: 006	225-250g
Gelfoam	CDMV	102348
Curved hemostat forceps	Fine Science Tools	13003-10
Hot bead sterilizer	Fine Science Tools	18000-45
Hydrogel	70-01-5022	Clear H20
Isofluorane	CDMV	118740
Lactated Ringer's solution	CDMV	116373
Lidocaine (2%)	CDMV	123684
Needle 30 ga	CDMV	4799
Open-field area	Custom		Circular Plexiglas arena 96 cm diameter, 40 cm wall height
Opthalmic ointment	CDMV	110704
Personal computer			With USB3 connectivity to record video with the listed camera
Physiological saline	CDMV	1399
Proviodine	CDMV	4568
Rodent Liquid Diet	Bioserv	F1268
Scalpal blade #11	CDMV	6671
Self-retaining retractor	World Precision Instruments	14240
Vannas iridectomy spring scissors	Fine Science Tools	15002-08
Veterinary Anesthesia Machine and isofluarane vaporizer	Dispomed	975-0510-000
VLC media player	VideoLAN		videolan.org/vlc