Immunolabelling Myofiber Dégénérescence dans les biopsies musculaires
Summary
Décrit ici est un protocole pour l’immunoétiquetage direct des myofibres nécrotiques dans les cryosections de muscle. Les cellules nécrotiques sont perméables aux protéines sériques, y compris l’immunoglobuline G (IgG). Révéler l’apport d’IgG par les myofibres permet l’identification et la quantification des myofibres qui subissent une nécrose indépendamment de l’état musculaire.
Abstract
La nécrose des fibres musculaires (myonécrose) joue un rôle central dans la pathogénie de plusieurs affections musculaires, y compris les dystrophies musculaires. On s’attend à ce que les options thérapeutiques s’attaquant aux causes de la pathogénie de dystrophie musculaire soulagent la dégénérescence de muscle. Par conséquent, une méthode pour évaluer et quantifier l’étendue de la mort cellulaire dans les biopsies musculaires est nécessaire. Les méthodes conventionnelles pour observer la dégénérescence myofibre in situ sont soit mal quantitatives, soit reposent sur l’injection de colorants vitaux. Dans cet article, un protocole d’immunofluorescence est décrit qui tache les myofibers nécrotiques en ciblant l’adoption d’immunoglobuline G (IgG) par myofibers. La méthode d’utilisation d’IgG est basée sur des dispositifs cellulaires caractérisant la disparition nécrotique, y compris 1) la perte de l’intégrité de membrane de plasma avec la libération des modèles moléculaires dommages-associés et 2) l’utilisation des protéines plasmatiques. Dans les coupes murines, la co-immunoétiquetage des myofibres, des protéines de matrice extracellulaire et de la souris IgG permet d’identifier proprement et simplement les myofibres avec le destin nécrotique. Cette méthode simple convient à l’analyse quantitative et s’applique à toutes les espèces, y compris les échantillons humains, et ne nécessite pas l’injection de colorant vital. La coloration des myofibres nécrotiques par l’utilisation d’IgG peut également être jumelée à d’autres co-immunoétiquetage.
Introduction
Le muscle squelettique strié se compose principalement de fibres musculaires (myofibers), qui sont responsables de la fonction contractuelle volontaire caractéristique. Ces cellules sont des structures post-mitotiques multinuclées qui soutiennent le stress mécanique pendant la contraction. La stabilité structurale de la membrane de myofiber (sarcolemma) et de sa matrice extracellulaire sont cruciales pour l’homéostasie de tissu. Les cellules satellites constituent la population principale d’ancêtres musculaires dans le muscle squelettique mature et existent dans un état quiescent dans les muscles sains. Après la mort de myofiber, la régénération de muscle est soutenue par des cellules satellites suivant un programme myogenic qui implique l’activation de cellules de satellite, la prolifération, la différenciation, et la fusion pour former en fin de compte de nouveaux myofibers multinucleateds.
La disparition de myofiber peut se produire dans les conditions musculaires multiples, y compris le trauma mécanique, les dommages de ischémie-reperfusion, ou les dystrophies musculaires, et elle est associée à la morphologie nécrotique des cellules mortes1,2. La mort nécrotique se caractérise par la perméabilité rapide de la membrane plasmatique et la libération de contenu cellulaire dans le compartiment extracellulaire3. Elle peut résulter soit d’un processus non réglementé impliquant aucune signalisation cellulaire appropriée (c.-à-d. nécrose accidentelle), soit d’une voie intracellulaire orchestrée (c.-à-d. nécrose réglementée). Dans les myofibers, les processus réglementés4 et non réglementés5 peuvent conduire à la nécrose. Une conséquence typique de la myonécrose est la libération de modèles de molécules associés aux dommages, activant une réponse inflammatoire puissante6. La présence de macrophages est observée à environ 48 h et 72 h après une blessure7. Outre leur rôle dans le déblaiement des débris nécrotiques, ils sont également importants dans la régénération musculaire8,9.
Les dystrophies musculaires (MD) sont un groupe hétérogène de pathologies qui résultent souvent d’un défaut dans la structure de sarcolemma. La dystrophie musculaire de Duchenne (DMD) est une maladie juvénile liée à l’X qui touche environ 1 naissance masculine sur 3 500 dans le monde10,et elle est causée par l’absence d’expression de la dystrophine au sarcolemma. La dégénérescence chronique du tissu musculaire chez les garçons DMD conduit à une faiblesse musculaire extrême et la mortalité précoce. L’inflammation résultant de la mort nécrotique améliore la cytotoxicité, et favorise la fibrose musculaire et la perte de la fonction musculaire11,12. Les traitements actuellement en essais cliniques ciblant les racines des troubles dégénératifs musculaires, tels que la thérapie génique, devraient soulager la myonécrose. Des techniques simples pour quantifier avec précision la dégénérescence musculaire sont donc nécessaires.
Plusieurs méthodes sont couramment utilisées pour surveiller la perte de myofibre in vivo. La mesure de l’activité enzymatique de la créatine kinase (CK) dans le sang permet une quantification fiable de la nécrose continue dans les tissus musculaires et cardiaques. In situ, la coloration de l’hématoxylin et de l’éosine est la méthode la plus populaire actuellement utilisée dans le diagnostic pour évaluer le remodelage dégénérescence-régénération. Cependant, la base moléculaire de l’étiquetage des cellules mortes de h et E demeure incertaine. En outre, les modifications de couleur suggérant la mort de myofiber dans la coloration de H et E sont relativement subtiles et ne facilitent pas la quantification fiable et reproductible. Méthodes révélant la fragmentation de l’ADN, comme le terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end label (TUNEL), imparfaitement étiquette mort nécrotique3. Ils sont également mal adaptés pour surveiller la mort des cellules syncytiales telles que les myofibres. L’injection de colorants vitaux, comme le colorant bleu d’Evan (DME), représente une alternative utile pour évaluer les myofibres qui ont perdu l’intégrité du sarcolamme, mais n’est pas nécessairement pratique dans certains protocoles expérimentaux. Par exemple, la présence d’EBD dans les échantillons de sang peut affecter les résultats des mesures de CK, un test coloriable. En outre, l’utilisation intracellulaire de l’EBD rend la co-immunoétiquetage difficile. Par conséquent, une méthode alternative permettant l’étiquetage direct des myofibres subissant une nécrose est intéressante.
Le mécanisme d’action des colorants vitaux repose sur la perte de l’intégrité de la membrane plasmatique dans les myofibres nécrotiques et l’apport passif du colorant injecté. De même, les myofibres nécrotiques préservent les protéines sanguines telles que l’albumine, pour laquelle l’EBD a une forte affinité13,14, immunoglobuline G (IgG), et IgM15. La présence anormale de protéines sanguines dans les myofibres représente donc des marqueurs pratiques pour la myonécrose in situ. La coloration de ces protéines peut être une alternative pour l’utilisation de colorants vitaux.
En utilisant l’utilisation d’igG comme marqueur de myonecrosis in situ, ce protocole est employé pour évaluer la dégénérescence de muscle dans le tibialis antérieur (TA) des souris dystrophine-déficientes de mdx. Cette méthode présente des avantages significatifs par rapport aux techniques alternatives : 1) elle est reproductible et simple dans son exécution ; 2) il ne nécessite aucun traitement animal avant la collecte de muscle, tel que l’injection des colorants vitaux circulants, et 3) comme n’importe quel immunoétiquetage conventionnel, il est compatible avec le co-étiquetage.
Protocol
Representative Results
Discussion
La nécrose de myofiber est une conséquence commune de l’exercice traumatique dans les muscles normaux. Il est bien compensé par une puissante capacité régénératrice des ancêtres musculaires locaux. Cependant, dans plusieurs conditions musculaires telles que dans les MD, la capacité régénératrice des cellules satellites est compromise par la myonécrose chronique et la fibrose excessive. Des résultats récents montrent que les fibres musculaires peuvent mourir par nécroptose, une forme réglementée de nécr…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par l’Association Française contre les Myopathies avec le programme Translamuscle. Les auteurs remercient le Dr Perla Reyes-Fernandez et le Dr Matthew Borok pour leur lecture attentive du manuscrit.
Materials
| Circular cork disks | Pyramid Innovation | R30001-E | Don't forget to clearly label the cork so that the the ID of the sample can be determined after freezing |
| Cryostat | Leica | CM3050 sn34 | Muscle cryosectionning should be performed between -20 and -25°C. Thickness:7-10 micrometers. |
| Dakopen | Dako | S2002 | A hydrophobic barrier around the muscle sections. It prevents the dispertion of medium during incubation |
| Forceps | FST | 91117-10 | / |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) antibody, Alexa Fluor Plus 488 | ThermoFischer Scientific | A-11029 | Dilution: 1/500 |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) antibody Alexa Fluor Plus 594 | ThermoFischer Scientific | A32740 | Dilution: 1/500 |
| Goat serum | Jackson ImmunoResearch | 005-000-121 | At the blocking step, use 10% dilution in PBS. For antibodies incubation, use 5% dilution in PBS |
| Isopentane | Sigma Aldrich | 78-78-4 | Freezing medium. Should be cooled down in a beaker placed in liquid nitrogen. |
| mdx mouse | Jackson Laboratory | C57BL/10ScSn-Dmdmdx/J | Mdx mice are mutated for the dystrophin gene. From three weeks of age, muscles are characterized by chronic degeneration |
| Microscope | Zeiss | Imager.D1 | / |
| OCT | Cellpath | KMA-0100-00A | Embedding matrix |
| PFA (Paraformaldehyde) | ThermoFischer Scientific | 28908 | Used for fixing cryosection (2% or 4% PFA can be used) |
| PBS | Eurobio | CS3PBS00-01 | Dilution medium for immunolabeling |
| Precision scisors | FST | fst 14001-12 and fst 14001-14 | Used for the muscle collection |
| Rabbit antibody to mouse pan-Laminin | Sigma Aldrich | L9393 | Dilution: 1/1000 |
| Tragacanth | Sigma Aldrich | G1128 | Aliquots to keep at +4°C |
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