Medição de BK-Polyomavirus não-codificação região controle driven transcriptional atividade via citometria de fluxo

Summary

Neste manuscrito, um protocolo é apresentado para executar a medida FACS-baseada da atividade transcricional de BK-Polyomavirus usando as pilhas HEK293T transfected com um plasmídeo bidirecional do repórter que expressa tdtomato e EGFP. Este método permite determinar quantitativamente a influência de novos compostos na transcrição viral.

Abstract

Os poliomavírus, como o BK-Polyomavirus (BKPyV), podem causar patologias severas em pacientes imunocomprometidos. No entanto, uma vez que os antivirais altamente eficazes não estão atualmente disponíveis, são necessários métodos que medem o impacto de potenciais agentes antivirais. Aqui, um repórter de fluorescência dupla que permite a análise do BKPyV não-codificação de controle-região (NCCR) impulsionado atividade precoce e tardia promotor foi construído para quantificar o impacto de potenciais medicamentos antivirais na expressão gênica viral via tdTomato e eGFP Expressão. Além, clonando os amplicões de bkpyv-nccr que neste protocolo foram obtidos exemplarmente do ADN sangue-derivado de pacientes transplantados renais imunocomprometidos, o impacto de nccr-rearranjos na expressão de gene viral pode ser determinado. Depois da clonagem dos amplicons derivados pacientes, as pilhas HEK293T foram transfected com o repórter-Plasmids, e tratadas com os agentes antivirais potenciais. Subseqüentemente, as pilhas foram sujeitadas a FACS-análise para medir as intensidades médias da fluorescência 72 h transfection do borne. Para testar também a análise de drogas que têm um potencial efeito inibidor do ciclo celular, apenas transfected e, portanto, as células fluorescentes são usadas. Desde que este ensaio é executado no grande antígeno de T que expressa pilhas, o impacto da expressão adiantada e atrasada pode ser analisado em uma maneira mutuamente independente.

Introduction

Os poliomavírus representam uma família independente de pequenos vírus de DNA duplo-encalhado (dsDNA) com o vírus Simian 40 (SV40) como uma espécie de protótipo. A infecção primária ocorre principalmente durante a infância, que geralmente prosseguem sem sintomas de doença e geralmente causam infecções latentes em hospedeiros competentes imunológicos. O BK-Polyomavirus (BKPyV) persiste principalmente em células tubulares renais sem causar nefropatologia, no entanto, em caso de comprometimento da imuno-competência após o transplante renal, o vírus pode reativar e causar danos graves e comprometimento do enxerto função ao atingir uma viremia alta (1 x 10⁴ bkpyv DNA cópias/ml)^1,2. Em aproximadamente 10% dos receptores de transplante renal, a reativação do BK-Polyomavirus (bkpyv) resulta em uma nefropatia associada ao poliomavírus (pyvan), que foi de até 80% associada a um alto risco de falhas renais do aloenxerto^3,4 . Desde que nenhum agente antiviral aprovado está disponível, a terapia atual é baseada na redução do immunosuppression. Curiosamente, os inibidores de mTOR parecem ter um efeito antiviral; assim, comutar a terapia imunossupressores ao imunossupressão mTOR-baseado pôde representar uma aproximação alternativa para impedir a progressão do bkpyv viremia^5,6,7. No entanto, o mecanismo antiviral baseado em mTOR é atualmente ainda incompletamente compreendido. Assim, são necessários métodos que medem o impacto de potenciais agentes antivirais em concentrações clinicamente relevantes.

O genoma circular do BKPyV consiste em aproximadamente 5 KB abrigando uma região de controle não-codificante (NCCR) que serve como uma origem de replicação e concomitantemente um promotor bidirecional dirigindo a expressão de transcrições de mRNA de fase precoce e tardia. Desde que ocorra espontâneamente nccr-rearranjos, deleções, e duplicações são encontrados no bkpyv patogénico⁸ e acumulado significativamente nos pacientes que sofrem de pvan^5,9, uma comparação de arquetípico (WT) e Re-arranjado (RR) NCCR-atividades são úteis para caracterizar a aptidão replicativa viral.

Como resumido na Figura 1, este protocolo descreve um método comumente usado para medir a atividade transcricional de BKPyV nccr quantificando a fluorescência de dois fluoróforos tdTomato e EGFP expressos a partir de um repórter plasmídeo^{5, 9,10,11}. O procedimento é realizado na presença do antígeno T SV40 grande (lTAg), que permite analisar o impacto de potenciais agentes antivirais na atividade de NCCR precoce e tardia separadamente⁵. Este ensaio analisa ainda mais o impacto dos rearranjos sobre a atividade da nccr e a comparação com o WT-nccrs^5,9. O plasmídeo do repórter abriga o sinal atrasado da poliadenilação SV40 a jusante de cada frame de leitura aberto do fluoróforo para assegurar o processamento comparável e eficiente de ambos os transcritos para tdtomato e EGFP, respectivamente. Comparado aos métodos baseados em qRT-PCR^5,12, esta aproximação FACS-baseada representa uma alternativa compatível do baixo custo e da taxa de transferência elevada desde nenhuns protocolos complicados da extração para a cultura de pilha contaminada e nenhum caro os anticorpos para a mancha imune da fluorescência são necessários. Além disso, uma vez que uma quantidade definida de células fluorescentes é analisada através da citometria de fluxo, a análise dos agentes inibidores do ciclo celular também é possível de forma quantitativa.

Protocol

Este protocolo segue as diretrizes da pesquisa humana, conforme aprovado pelo Comitê de ética da faculdade de medicina da Universidade de Duisburg-Essen (14-6028-BO). 1. coleta de amostras de sangue ou urina e isolamento de DNA de poliomavirus Colete pelo menos 3 mL de sangue em tubos de EDTA ou urina em tubos de aquisição. Centrifugue a amostra a 2.500 x g durante 15 min. Se necessário, pipeta o plasma em um tubo novo e armazene as amostras do plasma em 4 ° …

Representative Results

Neste experimento representativo, a atividade transcricional da região de controle não-codificante BK-Polyomavirus foi mensurada via citometria de fluxo. Além, um inibidor de mTOR, que possa ser usado para tratar pacientes após o reactivation de BKPyV, foi testado para sua inibição da expressão adiantada viral do gene. Para tal, utilizou-se um ensaio de dupla fluorescência-repórter como publicado anteriormente5. O esquema de fluxo de trabalho geral da conf…

Discussion

Neste artigo, um método comumente usado é apresentado que permite a análise do BKPyV não-codificação controle-região (NCCR) impulsionado atividade promotor precoce e tardia. A atividade da NCCR pode ser medida simultaneamente e não precisa de Lise das células transfectadas. Além disso, um número relativamente grande de pilhas pode ser analisado e o co-transfection de marcadores adicionais para a normalização dos valores da fluorescência não é necessário.

Uma parte crítica des…

Materials

100 bp ladder	NEB	N3231	Any ladder with a range up to 1 kb can be substituted
2-log ladder	NEB	N0550	Any ladder with a range up to 10 kb can be substituted
Agar-Agar, Kobe I	Carl Roth	5210.3
AgeI-HF	NEB	R3552
Ampicillin Natriumsalz Cellpure	Carl Roth	HP62.1
Aqua ad iniectabilia	Bbraun	2351744	can be substituted by any manufacturer
BD FACSCanto™ II	BD Biosciences
BD FACSDiva	BD Biosciences
DAPI	Sigma	10236276001
DFC450C camera module	Leica		Any camera can be used
DMEM	Gibco	41966-029	can be substituted by any manufacturer
DMIL LED microscope	Leica		Any fluorescence microscope can be used
DNA Blood Mini Kit	Qiagen	51104	can be substituted by any manufacturer
E.coli DH5alpha Competent Cells	Thermo Scientific	18258012
FBS Superior	MerckMillipore	50615	Any FBS can be used
FlowJo v10.5.3	FlowJo, LLC		Any flow cytometry software FBS can be used
Gel Loading Dye, Purple (6X)	NEB	B7024	Any 6x loading dye can be substituted
HEK293T cells	ATCC	11268	These cells constitutively express the simian virus 40 (SV40) large T antigen, and clone 17 was selected specifically for its high transfectability.
HERAcell® 240i CO2 Incubator	Thermo Scientific		can be substituted by any manufacturer
HotStar PCR kit	Qiagen	203203
Intas Gel documentation system	Intas		Any visualisation system for stained DNA containing agarose gels can be used
Low Melt Agarose	Biozym	850081	can be substituted by any manufacturer
Opti-MEM	Invitrogen	31985070	can be substituted by any manufacturer
pBKV (34-2)	ATCC	45025	Plasmid harboring the full-length genome of BKPyV strain Dunlop; was used as a positive control; DNA Seq. Acc.: KP412983
PBS	Gibco	14190-136
PCR Cycler MJ Mini 48-Well Personal Cycler	Bio-Rad	discontinued product	Any thermocycler can be used
PCR Nucleotide Mix, 10 mM	Promega	#C1145	can be substituted by any manufacturer
PCR1 and PCR2 Primers	metabion	not applicable	Desalted. Dilute to (10 µM) with PCR grade water
PenStrep (100x)	Gibco	15140-122	can be substituted by any manufacturer
Roti®-GelStain	Carl Roth	3865	A fluorescence based stain for measuring dsDNA concentration
SpeI-HF	NEB	R3133
T4-DNA Ligase	NEB	M0202
TransIT LT1	Mirus	MIR2300
Trypsin 0.05% – EDTA	Gibco	25300-054	can be substituted by any manufacturer
ZymoPURE II Plasmid Kit	Zymo	D4201	can be substituted by any manufacturer