유세포측정을 통한 BK-폴리오마바이러스 비코딩 제어 영역 구동 전사 활성 측정
Summary
이 원고에서, 프로토콜은 tdTomato 및 eGFP를 발현하는 양방향 리포터 플라스미드로 형질감염된 HEK293T 세포를 이용하여 BK-폴리오마바이러스 전사 활성의 FACS 기반 측정을 수행하기 위해 제시된다. 이 방법은 바이러스 전사에 대한 신규 화합물의 영향을 정량적으로 결정할 수 있게 한다.
Abstract
BK-폴리오마바이러스(BKPyV)와 같은 폴리오마바이러스는 면역 손상 환자에서 심각한 병리학을 유발할 수 있습니다. 그러나, 매우 효과적인 항 바이러스는 현재 사용할 수 없기 때문에, 잠재적인 항 바이러스 에이전트의 영향을 측정 하는 방법이 필요. 여기서, BKPyV 비코딩 제어 영역(NCCR)의 분석을 가능한 이중 형광 리포터는 tdTomato 및 eGFP를 통해 바이러스 유전자 발현에 대한 잠재적항바이러스 약물의 영향을 정량화하기 위해 구축되었다. 식. 또한, 본 프로토콜에서 면역손상신장 이식 환자의 혈액 유래 DNA로부터 예시적으로 수득된 BKPyV-NCCR 앰플리칸을 복제함으로써, NCCR 재배열이 바이러스 성 유전자 발현에 미치는 영향을 결정할 수 있다. 환자 유래 앰플리톤의 클로닝에 이어, HEK293T 세포를 리포터 플라스미드로 형질전환시키고, 잠재적인 항바이러스제로 치료하였다. 이어서, 세포는 평균 형광 강도 72시간 후 형질감염을 측정하기 위한 FACS 분석을 실시하였다. 또한 잠재적인 세포 주기 억제 효과가 있는 약물의 분석을 테스트하기 위해 형질감염 및 따라서 형광 세포만 사용됩니다. 이러한 분석이 큰 T 항원 발현 세포에서 수행되기 때문에, 조기 및 후기 발현의 영향은 상호 독립적인 방식으로 분석될 수 있다.
Introduction
폴리오마바이러스는 시미미안 바이러스 40(SV40)을 시제품 종으로 가진 작은 이중 가닥 DNA(dsDNA) 바이러스의 독립적인 군을 나타낸다. 1 차적인 감염은 일반적으로 질병 현상 없이 진행하고 일반적으로 면역 유능한 호스트에 있는 잠복 감염을 일으키는 원인이 되는 유년기 도중 주로 생깁니다. BK-폴리오마바이러스 (BKPyV)는 주로 신장 관 세포에서 신병요법을 일으키지 않고 지속하지만, 신장 이식 후 면역 능력이 손상된 경우 바이러스가 재활성화되어 심각한 손상및 이식 이식 장애를 일으킬 수 있습니다. 높은 비혈증에 도달할 때 기능 (1 x 104 BKPyV DNA 사본 / mL) 1,2. 신장 이식 수혜자의 대략 10%에서, BK-polyomavirus (BKPyV)의 재활성화는 신장 동종 이식 실패의 고위험과 관련되었던 80%까지 관련되었던 polyomavirus 관련되는 신장 병증 (PyVAN)귀착됩니다3,4 . 승인된 항바이러스제를 사용할 수 없기 때문에 현재 치료법은 면역 억제의 감소에 기초합니다. 흥미롭게도, mTOR 억제제는 항 바이러스 효과가있는 것 같다; 따라서, 면역억제 요법을 mTOR 계 면역억제로 전환하면 BKPyV 비레미아 5,6,7의 진행을 방지하는 대안적 접근법을 나타낼 수 있다. 그러나, mTOR 계 항바이러스 메커니즘은 현재 아직 불완전하게 이해된다. 따라서, 임상적으로 관련된 농도에서 잠재적항바이러스제의 영향을 측정하는 방법이 요구된다.
BKPyV의 원형 게놈은 약 5kb의 비코딩 제어 영역(NCCR)을 품고 복제의 기원역할을 하며, 이와 일치하게 초기 및 후기 단계 mRNA 전사체의 발현을 유도하는 양방향 프로모터로 구성된다. NCCR-재배열, 결실 및 중복이 병원성 BKPyV 8에서 발견되기 때문에 PVAN5,9,전형(wt)의 비교를 통해 유의하게 축적된 환자들로부터 재배열 (rr) NCCR 활동은 바이러스 복제 피트니스를 특성화하는 데 도움이됩니다.
도1에 요약된 바와 같이, 이 프로토콜은 기자 플라스미드 5로부터 발현된 두 개의 형광단 tdTomato 및 eGFP의 형광을 정량화함으로써 BKPyV NCCR 전사 활성을 측정하는 일반적인 방법을설명한다. 9,10,11. 절차는 SV40 대형 T 항원(lTAg)의 존재에서 수행되며, 이는 NCCR 활성 초기에 및 후기에 대한 잠재적항바이러스제의 영향을 별도로 분석할 수 있다5. 이 분석은 NCCR 활성에 대한 재배열의 영향을 추가로 분석하고 wt-NCCrRs5,9. 리포터 플라스미드는 각각 tdTomato 및 eGFP에 대한 두 전사체의 비교가능한 효율적인 처리를 보장하기 위해 각 형광부 개방 판독 프레임의 SV40 후기 폴리아데닐화 신호 하류를 항구합니다. qRT-PCR 기반 방법5,12에비해, 이 FACS 기반 접근법은 감염된 세포 배양에 대한 복잡한 추출 프로토콜이 없고 비용이 많이 들지 않으므로 저렴한 비용과 높은 처리량 호환 대안을 나타냅니다. 면역 형광 염색을 위한 항체가 필요합니다. 더욱이, 정의된 양의 형광세포가 유세포분석을 통해 분석되기 때문에, 세포주기 억제제의 분석도 정량적 방식으로 가능하다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 문서에서는, BKPyV 비코딩 제어 영역(NCCR) 구동 초기 및 후기 프로모터 활성의 분석을 허용하는 일반적으로 사용되는 방법이 제시된다. NCCR 활성은 동시에 측정될 수 있으며 형질감염된 세포의 라시스가 필요하지 않습니다. 더욱이, 비교적 많은 수의 세포를 분석할 수 있으며 형광 값의 정상화를 위한 추가 마커의 병용형화가 필요하지 않다.
이 방법의 중요한 부분은 복제된 N…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 우수한 기술 지원을 바바라 블레크만 감사합니다. 이러한 연구는 뒤스부르크 – 에센 의과 대학의 IFORES 프로그램과 대학 얼라이언스 루르와 메르카토르 연구 센터 루르 (MERCUR)의 RIMUR 프로그램에 의해 지원되었다. 저자들은 헬렌 세르츠니그 박사의 펠로우십과 지속적인 지원에 대해 위르겐-만초-스티퉁에게 감사를 표한다. 수집 및 환자 자료의 사용은 대학 뒤스부르크 – 에센의 의료 학부의 윤리위원회에 의해 승인되었습니다 (14-6028-BO).
Materials
| 100 bp ladder | NEB | N3231 | Any ladder with a range up to 1 kb can be substituted |
| 2-log ladder | NEB | N0550 | Any ladder with a range up to 10 kb can be substituted |
| Agar-Agar, Kobe I | Carl Roth | 5210.3 | |
| AgeI-HF | NEB | R3552 | |
| Ampicillin Natriumsalz Cellpure | Carl Roth | HP62.1 | |
| Aqua ad iniectabilia | Bbraun | 2351744 | can be substituted by any manufacturer |
| BD FACSCanto™ II | BD Biosciences | ||
| BD FACSDiva | BD Biosciences | ||
| DAPI | Sigma | 10236276001 | |
| DFC450C camera module | Leica | Any camera can be used | |
| DMEM | Gibco | 41966-029 | can be substituted by any manufacturer |
| DMIL LED microscope | Leica | Any fluorescence microscope can be used | |
| DNA Blood Mini Kit | Qiagen | 51104 | can be substituted by any manufacturer |
| E.coli DH5alpha Competent Cells | Thermo Scientific | 18258012 | |
| FBS Superior | MerckMillipore | 50615 | Any FBS can be used |
| FlowJo v10.5.3 | FlowJo, LLC | Any flow cytometry software FBS can be used | |
| Gel Loading Dye, Purple (6X) | NEB | B7024 | Any 6x loading dye can be substituted |
| HEK293T cells | ATCC | 11268 | These cells constitutively express the simian virus 40 (SV40) large T antigen, and clone 17 was selected specifically for its high transfectability. |
| HERAcell® 240i CO2 Incubator | Thermo Scientific | can be substituted by any manufacturer | |
| HotStar PCR kit | Qiagen | 203203 | |
| Intas Gel documentation system | Intas | Any visualisation system for stained DNA containing agarose gels can be used | |
| Low Melt Agarose | Biozym | 850081 | can be substituted by any manufacturer |
| Opti-MEM | Invitrogen | 31985070 | can be substituted by any manufacturer |
| pBKV (34-2) | ATCC | 45025 | Plasmid harboring the full-length genome of BKPyV strain Dunlop; was used as a positive control; DNA Seq. Acc.: KP412983 |
| PBS | Gibco | 14190-136 | |
| PCR Cycler MJ Mini 48-Well Personal Cycler | Bio-Rad | discontinued product | Any thermocycler can be used |
| PCR Nucleotide Mix, 10 mM | Promega | #C1145 | can be substituted by any manufacturer |
| PCR1 and PCR2 Primers | metabion | not applicable | Desalted. Dilute to (10 µM) with PCR grade water |
| PenStrep (100x) | Gibco | 15140-122 | can be substituted by any manufacturer |
| Roti®-GelStain | Carl Roth | 3865 | A fluorescence based stain for measuring dsDNA concentration |
| SpeI-HF | NEB | R3133 | |
| T4-DNA Ligase | NEB | M0202 | |
| TransIT LT1 | Mirus | MIR2300 | |
| Trypsin 0.05% – EDTA | Gibco | 25300-054 | can be substituted by any manufacturer |
| ZymoPURE II Plasmid Kit | Zymo | D4201 | can be substituted by any manufacturer |
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