I dette manuskriptet presenteres en protokoll for å utføre FACS-basert måling av BK-polyomavirus transcriptional aktivitet ved å bruke HEK293T celler transfekterte med en toveis reporter plasmider som uttrykker tdTomato og eGFP. Denne metoden videre gjør det mulig å kvantitativt bestemme innflytelsen av romanen forbindelser på viral transkripsjon.
Polyomaviruses, som BK-polyomavirus (BKPyV), kan forårsake alvorlige sykdommer hos immunsupprimerte pasienter. Men, siden svært effektive antivirale midler er for øyeblikket ikke tilgjengelig, metoder måle effekten av potensielle antivirale midler er nødvendig. Her, en dual fluorescens reporter som gjør at analysen av BKPyV ikke-koding kontroll-regionen (NCCR) drevet tidlig og sent promoter aktivitet ble konstruert for å kvantifisere effekten av potensielle antivirale legemidler på viral genuttrykk via tdTomato og eGFP Uttrykk. I tillegg, ved kloning BKPyV-NCCR amplicons som i denne protokollen har blitt eksempelvis innhentet fra blod-avledet DNA av immunsupprimerte nyretransplanterte pasienter, kan virkningen av NCCR-rearrangements på viral genuttrykk bestemmes. Etter kloning av pasienten avledet amplicons, HEK293T celler ble transfekterte med reporter-plasmider, og behandlet med potensielle antivirale midler. Deretter ble celler utsatt for FACS-analyse for måling bety fluorescens intensitet 72 h post transfeksjoner. Å også teste analyse av legemidler som har en potensiell celle syklus hemmende effekt, bare transfekterte og dermed fluorescerende celler brukes. Siden denne analysen er utført i store T antigen uttrykke celler, kan virkningen av tidlig og sent uttrykk analyseres på en gjensidig uavhengig måte.
Polyomaviruses representerer en uavhengig familie av små dobbel-strandet DNA (dsDNA) virus med Simian virus 40 (SV40) som en prototype arter. Den primære infeksjonen oppstår hovedsakelig i løpet av barndommen, som vanligvis går uten sykdomssymptomer og vanligvis forårsake latente infeksjoner i uimottakelig kompetente verter. Den BK-polyomavirus (BKPyV) hovedsakelig vedvarer i renal tubuli celler uten å forårsake nephropathologies, men i tilfelle av svekkelse av immun-kompetanse etter nyre transplantasjon viruset kan reaktivere og forårsake alvorlige skader og nedsatt pode funksjon når man når en høy viremia (1 x 104 BKPyV DNA eksemplarer/ml)1,2. I ca 10% av nyre transplantasjon mottakere, reaktivering av BK-polyomavirus (BKPyV) resulterer i en polyomavirus assosiert nefropati (PyVAN), som var opp til 80% assosiert med en høy risiko for nyres allograft svikt3,4 . Siden ingen godkjente antivirale midler er tilgjengelig, er aktuell behandling basert på reduksjon av immunsuppresjon. Interessant, mTOR hemmere synes å ha en antiviral effekt; Dermed kan det å bytte immunsuppressiv-behandlingen til mTOR-baserte immunsuppresjon representere en alternativ tilnærming for å hindre progresjon av BKPyV viremia5,6,7. Imidlertid, det mTOR-basert antiviral mekanikk er aktuelle fremdeles ufullstendig forstod. Dermed kreves metoder som måler virkningen av potensielle antivirale midler i klinisk relevante konsentrasjoner.
Den sirkulære Genova av BKPyV består av ca 5 kb harboring en ikke-koding kontroll region (NCCR) som fungerer som en opprinnelse av replikering og samtidig en toveis promoter kjører uttrykk for tidlig og sent fase mRNA transkripsjoner. Siden spontant forekommende NCCR-rearrangements, slettinger og duplikasjoner finnes i patogene BKPyV8 og signifikant akkumulert hos pasienter som lider av PVAN5,9, en sammenligning av arketypiske (WT) og re-arrangert (RR) NCCR-aktiviteter er nyttig å karakterisere viral replicative fitness.
Som oppsummert i figur 1, beskriver denne protokollen en vanlig brukt metode for å måle BKPyV NCCR transcriptional aktivitet ved kvantifisere fluorescens av to fluorophores TdTomato og eGFP uttrykt fra en reporter plasmider5, 9,10,11. Prosedyren utføres i nærvær av SV40 store T antigen (lTAg), som gjør det mulig å analysere virkningen av potensielle antivirale midler på tidlig og sent NCCR-aktivitet separat5. Denne analysen analyserer videre virkningen av rearrangements på NCCR aktivitet og sammenligning med WT-NCCRs5,9. Reporteren plasmider havner i SV40 sent polyadenylation signal nedstrøms for hver fluoroforen åpne lese ramme for å sikre sammenlignbare og effektiv behandling av både transkripsjoner for tdTomato og eGFP, henholdsvis. Sammenlignet med qRT-PCR baserte metoder5,12, denne FACS-basert tilnærming representerer en lav kostnad og høy gjennomstrømming kompatibelt alternativ siden ingen kompliserte utvinning protokoller for infiserte cellekultur og ingen dyre antistoffer for immun fluorescens farging er nødvendig. Videre, siden en definert mengde fluorescerende celler er analysert via Flow flowcytometri, analyse av celle syklus hemme agenter er også mulig i en kvantitativ måte.
I denne artikkelen presenteres en ofte brukt metode som gjør det mulig for analyse av BKPyV ikke-koding kontroll-region (NCCR) drevet tidlig og sent promoter aktivitet. Den NCCR aktivitet kan måles samtidig og trenger ikke lyse av transfekterte celler. Videre kan et relativt stort antall celler bli analysert og co-transfeksjoner av ekstra markører for normalisering av de fluorescens verdiene er ikke nødvendig.
En kritisk del av denne metoden er at klonet NCCR skal inneholde nøyaktig de sa…
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne takker Barbara Bleekmann for utmerket teknisk assistanse. Disse studiene ble støttet av IFORES-programmet ved Universitetet i Duisburg-Essen Medical School og RIMUR-programmet ved University Alliance Ruhr and Mercator Research Center Ruhr (MERCUR). Forfatterne takker Jürgen-Manchot-Stiftung for doktorgrads fellesskap av Helene Sertznig og konstant støtte. Innsamling og bruk av pasient materiale har blitt godkjent av etikk komité for medisinsk fakultet ved Universitetet Duisburg-Essen (14-6028-BO).
100 bp ladder | NEB | N3231 | Any ladder with a range up to 1 kb can be substituted |
2-log ladder | NEB | N0550 | Any ladder with a range up to 10 kb can be substituted |
Agar-Agar, Kobe I | Carl Roth | 5210.3 | |
AgeI-HF | NEB | R3552 | |
Ampicillin Natriumsalz Cellpure | Carl Roth | HP62.1 | |
Aqua ad iniectabilia | Bbraun | 2351744 | can be substituted by any manufacturer |
BD FACSCanto™ II | BD Biosciences | ||
BD FACSDiva | BD Biosciences | ||
DAPI | Sigma | 10236276001 | |
DFC450C camera module | Leica | Any camera can be used | |
DMEM | Gibco | 41966-029 | can be substituted by any manufacturer |
DMIL LED microscope | Leica | Any fluorescence microscope can be used | |
DNA Blood Mini Kit | Qiagen | 51104 | can be substituted by any manufacturer |
E.coli DH5alpha Competent Cells | Thermo Scientific | 18258012 | |
FBS Superior | MerckMillipore | 50615 | Any FBS can be used |
FlowJo v10.5.3 | FlowJo, LLC | Any flow cytometry software FBS can be used | |
Gel Loading Dye, Purple (6X) | NEB | B7024 | Any 6x loading dye can be substituted |
HEK293T cells | ATCC | 11268 | These cells constitutively express the simian virus 40 (SV40) large T antigen, and clone 17 was selected specifically for its high transfectability. |
HERAcell® 240i CO2 Incubator | Thermo Scientific | can be substituted by any manufacturer | |
HotStar PCR kit | Qiagen | 203203 | |
Intas Gel documentation system | Intas | Any visualisation system for stained DNA containing agarose gels can be used | |
Low Melt Agarose | Biozym | 850081 | can be substituted by any manufacturer |
Opti-MEM | Invitrogen | 31985070 | can be substituted by any manufacturer |
pBKV (34-2) | ATCC | 45025 | Plasmid harboring the full-length genome of BKPyV strain Dunlop; was used as a positive control; DNA Seq. Acc.: KP412983 |
PBS | Gibco | 14190-136 | |
PCR Cycler MJ Mini 48-Well Personal Cycler | Bio-Rad | discontinued product | Any thermocycler can be used |
PCR Nucleotide Mix, 10 mM | Promega | #C1145 | can be substituted by any manufacturer |
PCR1 and PCR2 Primers | metabion | not applicable | Desalted. Dilute to (10 µM) with PCR grade water |
PenStrep (100x) | Gibco | 15140-122 | can be substituted by any manufacturer |
Roti®-GelStain | Carl Roth | 3865 | A fluorescence based stain for measuring dsDNA concentration |
SpeI-HF | NEB | R3133 | |
T4-DNA Ligase | NEB | M0202 | |
TransIT LT1 | Mirus | MIR2300 | |
Trypsin 0.05% – EDTA | Gibco | 25300-054 | can be substituted by any manufacturer |
ZymoPURE II Plasmid Kit | Zymo | D4201 | can be substituted by any manufacturer |