Mätning av BK-polyomavirus icke-kodning kontroll region driven transkriptionell aktivitet via flödescytometri

Summary

I detta manuskript, ett protokoll presenteras för att utföra FACS-baserade mätningar av BK-polyomavirus transkriptionell aktivitet genom att använda HEK293T celler transfekterade med en dubbelriktad reporter plasmid uttrycker tdtomato och egfp. Denna metod gör det möjligt att kvantitativt bestämma påverkan av nya föreningar på viral transkription.

Abstract

Polyomaviruser, som BK-polyomavirus (BKPyV), kan orsaka allvarliga patologier hos patienter med nedsatt immunförsvar. Eftersom mycket effektiva antivirala läkemedel för närvarande inte är tillgängliga krävs dock metoder för att mäta effekten av potentiella antivirala medel. Här har en dubbel fluorescensreporter som gör det möjligt att analysera den icke-kodande kontroll region (NCCR) som är driven i början och slutet av promotorn för att kvantifiera effekten av potentiella antivirala läkemedel på virus genuttryck via tdTomato och eGFP Uttryck. Genom kloning av BKPyV-NCCR-amplikoner som i detta protokoll exemplärt har erhållits från det blodbaserade DNA hos immunsupprimerade njurtransplanterade patienter kan effekten av NCCR-omordningar på viral genuttryck bestämmas. Efter kloning av patienten härledda amplicons, HEK293T celler var transfekterade med rapportör-plasmider, och behandlas med potentiella antivirala medel. Därefter utsattes celler för FACS-analys för mätning av medelvärdet för fluorescensintensiteter 72 h efter transfektion. För att också testa analysen av läkemedel som har en potentiell cell cykelhämmande effekt, endast transfekterade och därmed fluorescerande celler används. Eftersom denna analys utförs i stora T antigen uttrycker celler, effekterna av tidigt och sent uttryck kan analyseras på ett ömsesidigt oberoende sätt.

Introduction

Polyomaviruses representerar en självständig familj av små dubbelsträngade DNA (dsDNA) virus med Simian virus 40 (SV40) som en prototyp art. Den primära infektionen uppstår främst under barndomen, som vanligtvis fortsätter utan sjukdomssymtom och oftast orsaka latent infektioner i immunförsvaret kompetenta värdar. BK-polyomavirus (BKPyV) består i huvudsak av njurtubuli celler utan att orsaka nefropatier, men i händelse av försämring av immun-kompetensen efter njurtransplantation kan viruset återaktivera och orsaka allvarliga skador och försämrad transplantat funktion när man når en hög viremia (1 x 10⁴ bkpyv DNA kopior/ml)^1,2. Hos cirka 10% av mottagarna av njurtransplantat, reaktivering av BK-polyomavirus (bkpyv) resulterar i en polyomavirus associerad nefropati (pyvan), som var upp till 80% förknippad med en hög risk för renal allograffel^3,4 . Eftersom inga godkända antivirala medel finns tillgängliga, är nuvarande behandling baserad på reduktion av immunsuppression. Intressant, mTOR-hämmare verkar ha en antiviral effekt; Således, byta immunsuppressiv behandling till mTOR-baserad immunsuppression kan utgöra en alternativ metod för att förhindra progression av bkpyv viremia^5,6,7. Men den mTOR-baserade antivirala mekanismen är för närvarande fortfarande ofullständigt förstådd. Därför krävs metoder för att mäta effekten av potentiella antivirala medel i kliniskt relevanta koncentrationer.

Den cirkulära genomet i BKPyV består av cirka 5 KB härbärga en icke-kodning kontroll region (NCCR) som fungerar som ett ursprung för replikering och samtidigt en dubbelriktad promotor kör uttrycket av tidiga och sena fas mRNA utskrifter. Eftersom spontant förekommande nccr-omordningar, borttagningar och dubbleringar påträffas i patogena bkpyv⁸ och ackumuleras signifikant hos patienter som lider av PVAN-^5,9, en jämförelse av arketetypikal (WT) och omarrangerade (RR) NCCR-aktiviteter är till hjälp för att karakterisera viral replikativ kondition.

Som sammanfattas i figur 1, beskriver detta protokoll en metod som ofta används för att mäta BKPyV nccr-transkriptionsaktivitet genom att kvantifiera fluorescensen hos två fluorofomedel tdTomato och egfp som uttrycks från en reporter plasmid^{5, 9,10,11}. Förfarandet utförs i närvaro av SV40 stora T-antigen (lTAg), som gör det möjligt att analysera effekterna av potentiella antivirala medel på tidig och sen NCCR-aktivitet separat⁵. Denna analys analyserar ytterligare effekten av omordningar på nccr-aktiviteten och jämförelse med WT-nccrs^5,9. Reportern plasmid hamnar den SV40 sena polyadenylering signalen nedströms varje fluorophore öppen läsbild för att säkerställa jämförbar och effektiv bearbetning av båda avskrifter för tdTomato och eGFP, respektive. Jämfört med QRT-PCR-baserade metoder^5,12, detta FACS-baserade tillvägagångssätt representerar en låg kostnad och hög genomströmning kompatibelt alternativ eftersom inga komplicerade utvinning protokoll för infekterade cellkulturen och inga dyra antikroppar mot immunfluorescens färgning behövs. Dessutom, eftersom en definierad mängd fluorescerande celler analyseras via flödescytometri, är analysen av cell cykelhämmande medel också möjligt på ett kvantitativt sätt.

Protocol

Detta protokoll följer de riktlinjer för mänsklig forskning som godkänts av etikkommittén för medicinska fakulteten vid universitetet i Duisburg-Essen (14-6028-BO). 1. insamling av blod-eller urinprov och isolering av polyomavirus DNA Samla in minst 3 mL blod i EDTA-rör eller urin i inhämtande rör. Centrifugera provet på 2 500 x g i 15 min. Vid behov Pipettera plasma i ett nytt rör och förvara plasmaproverna vid 4 ° c i flera dagar eller frys vid-20 °…

Representative Results

I detta representativa experiment mättes BK-polyomavirus icke-kodande kontroll region driven transkriptionell aktivitet via flödescytometri. Dessutom testades en mTOR-hämmare, som kan användas för att behandla patienter efter reaktivering av BKPyV, för sin hämning av det virala tidiga genuttrycket. För detta ändamål användes en dual Fluorescence-reporter-analys som publicerades tidigare5. Det övergripande arbetsflödessystemet i den experimentella insta…

Discussion

I den här artikeln presenteras en vanlig metod som gör det möjligt för analys av BKPyV icke-kodning Control-region (NCCR) driven tidig och sen promotor aktivitet. Nccr-aktiviteten kan mätas samtidigt och behöver inte lys av de transfekterade cellerna. Dessutom kan ett relativt stort antal celler analyseras och co-transfektion av ytterligare markörer för normalisering av fluorescensvärden är inte nödvändigt.

En kritisk del av denna metod är att den klonade nccr bör innehålla exak…

Materials

100 bp ladder	NEB	N3231	Any ladder with a range up to 1 kb can be substituted
2-log ladder	NEB	N0550	Any ladder with a range up to 10 kb can be substituted
Agar-Agar, Kobe I	Carl Roth	5210.3
AgeI-HF	NEB	R3552
Ampicillin Natriumsalz Cellpure	Carl Roth	HP62.1
Aqua ad iniectabilia	Bbraun	2351744	can be substituted by any manufacturer
BD FACSCanto™ II	BD Biosciences
BD FACSDiva	BD Biosciences
DAPI	Sigma	10236276001
DFC450C camera module	Leica		Any camera can be used
DMEM	Gibco	41966-029	can be substituted by any manufacturer
DMIL LED microscope	Leica		Any fluorescence microscope can be used
DNA Blood Mini Kit	Qiagen	51104	can be substituted by any manufacturer
E.coli DH5alpha Competent Cells	Thermo Scientific	18258012
FBS Superior	MerckMillipore	50615	Any FBS can be used
FlowJo v10.5.3	FlowJo, LLC		Any flow cytometry software FBS can be used
Gel Loading Dye, Purple (6X)	NEB	B7024	Any 6x loading dye can be substituted
HEK293T cells	ATCC	11268	These cells constitutively express the simian virus 40 (SV40) large T antigen, and clone 17 was selected specifically for its high transfectability.
HERAcell® 240i CO2 Incubator	Thermo Scientific		can be substituted by any manufacturer
HotStar PCR kit	Qiagen	203203
Intas Gel documentation system	Intas		Any visualisation system for stained DNA containing agarose gels can be used
Low Melt Agarose	Biozym	850081	can be substituted by any manufacturer
Opti-MEM	Invitrogen	31985070	can be substituted by any manufacturer
pBKV (34-2)	ATCC	45025	Plasmid harboring the full-length genome of BKPyV strain Dunlop; was used as a positive control; DNA Seq. Acc.: KP412983
PBS	Gibco	14190-136
PCR Cycler MJ Mini 48-Well Personal Cycler	Bio-Rad	discontinued product	Any thermocycler can be used
PCR Nucleotide Mix, 10 mM	Promega	#C1145	can be substituted by any manufacturer
PCR1 and PCR2 Primers	metabion	not applicable	Desalted. Dilute to (10 µM) with PCR grade water
PenStrep (100x)	Gibco	15140-122	can be substituted by any manufacturer
Roti®-GelStain	Carl Roth	3865	A fluorescence based stain for measuring dsDNA concentration
SpeI-HF	NEB	R3133
T4-DNA Ligase	NEB	M0202
TransIT LT1	Mirus	MIR2300
Trypsin 0.05% – EDTA	Gibco	25300-054	can be substituted by any manufacturer
ZymoPURE II Plasmid Kit	Zymo	D4201	can be substituted by any manufacturer