Vibrio fischeri आइसोलेट्स के बीच प्रतियोगी बातचीत की मात्रा निर्धारित करने के लिए सिक्काकरण परख
Summary
बैक्टीरिया अंतरजीवाणु प्रतियोगिता में उलझाने के लिए विभिन्न तंत्र ोंकोश. यहाँ, हम जीवाणु अलग के बीच प्रतिस्पर्धी बातचीत की विशेषता के लिए एक संस्कृति आधारित प्रोटोकॉल पेश करते हैं और कैसे वे एक मिश्रित आबादी के स्थानिक संरचना को प्रभावित करते हैं.
Abstract
इस पांडुलिपि का पता लगाने और दो जीवाणु आबादी के बीच प्रतिस्पर्धी बातचीत की विशेषता के लिए एक संस्कृति आधारित, coincubation परख का वर्णन करता है. इस विधि स्थिर प्लाज्मिड है कि प्रत्येक आबादी अलग एंटीबायोटिक प्रतिरोध क्षमताओं और चयन और प्रत्येक जनसंख्या के दृश्य भेदभाव के लिए फ्लोरोसेंट प्रोटीन के साथ टैग किया जा करने की अनुमति कार्यरत हैं. यहाँ, हम प्रतिस्पर्धा Vibrio fischeri उपभेदों, फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी इमेजिंग, और मात्रात्मक डेटा विश्लेषण की तैयारी और coincubation का वर्णन. इस दृष्टिकोण सरल है, पैदावार त्वरित परिणाम, और निर्धारित करने के लिए कि क्या एक जनसंख्या मारता है या एक और आबादी के विकास को रोकता है इस्तेमाल किया जा सकता है, और क्या प्रतियोगिता एक diffusible अणु के माध्यम से मध्यस्थता है या प्रत्यक्ष सेल सेल संपर्क की आवश्यकता है. क्योंकि प्रत्येक जीवाणु आबादी एक अलग फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त करता है, परख एक मिश्रित कॉलोनी के भीतर प्रतिस्पर्धा आबादी के स्थानिक भेदभाव की अनुमति देता है. हालांकि वर्णित तरीकों सहजीवी जीवाणु वी fischeri इस प्रजाति के लिए अनुकूलित शर्तों का उपयोग कर के साथ प्रदर्शन कर रहे हैं, प्रोटोकॉल सबसे कृषि योग्य जीवाणु अलग के लिए अनुकूलित किया जा सकता है.
Introduction
इस पांडुलिपि में यह निर्धारित करने के लिए एक संस्कृति-आधारित विधि की रूपरेखा दी गई है कि क्या दो जीवाणु अलग-अलग प्रतिस्पर्धी बातचीत करने में सक्षम हैं। मिश्रित आबादी का अध्ययन करते समय, यह निर्धारित करना महत्वपूर्ण है कि जीवाणु अलग-थलग किस सीमा तक बातचीत करते हैं, विशेष रूप से कि क्या अलग-अलग सीधे हस्तक्षेप तंत्र के माध्यम से प्रतिस्पर्धा कर रहे हैं। व्यतिकरण प्रतियोगिता उन अन्योन्यक्रियाओं को संदर्भित करती है जहां एक जनसंख्या सीधे वृद्धि को रोकती है या प्रतिस्पर्धी जनसंख्या1को मारता है . इन बातचीत की पहचान करने के लिए महत्वपूर्ण हैं क्योंकि वे एक माइक्रोबियल समुदाय की संरचना और समारोह2,3पर गहरा प्रभाव हो सकता है.
माइक्रोबियल प्रतियोगिता के लिए तंत्र व्यापक रूप से मेजबान संबद्ध और मुक्त रहने वाले बैक्टीरिया4,5,6,7, सहित विभिन्न वातावरण से बैक्टीरिया के जीनोम में मोटे तौर पर खोज की गई है, 8,9. विभिन्न प्रकार की प्रतिस्पर्धा रणनीतियों का वर्णन किया गया है10,11 जिसमें अंतरगम्य तंत्र शामिल हैं, जैसे जीवाणुनाशक रसायन1,12 और स्रावित एंटीमाइक्रोबियल पेप्टाइड्स13 , साथ ही संपर्क पर निर्भर तंत्र है कि सेल सेल संपर्क की आवश्यकता के लिए लक्ष्य कोशिकाओं9,14,15,16,17 में एक निरोधात्मक प्रभावक हस्तांतरण ,18.
हालांकि संस्कृति आधारित coincubations आमतौर पर सूक्ष्म जीव विज्ञान में उपयोग किया जाता है5,8,19, इस पांडुलिपि कैसे परख का उपयोग करने के लिए प्रतियोगिता के तंत्र की विशेषता है, साथ ही अनुकूलन के लिए सुझाव रूपरेखा अन्य जीवाणु प्रजातियों के साथ उपयोग के लिए प्रोटोकॉल. इसके अलावा, इस विधि का विश्लेषण करने और डेटा पेश करने के लिए प्रतिस्पर्धी बातचीत की प्रकृति के बारे में विभिन्न सवालों के जवाब देने के लिए कई दृष्टिकोण का वर्णन करता है. हालांकि यहाँ वर्णित तकनीक पहले से इस्तेमाल किया गया interbactrial हत्या तंत्र coisolated Vibrio fischeri बैक्टीरिया के सहजीवी उपभेदों के बीच intraspecific प्रतियोगिता अंतर्निहित की पहचान करने के लिए19, वे के लिए उपयुक्त हैं पर्यावरणीय अलग और मानव रोगजनकों सहित कई जीवाणु प्रजातियों, और दोनों संपर्क पर निर्भर और diffusible प्रतिस्पर्धी तंत्र का मूल्यांकन करने के लिए उपयोग किया जा सकता है. प्रोटोकॉल में कदम अन्य जीवाणु प्रजातियों के लिए अनुकूलन की आवश्यकता हो सकती है. यह देखते हुए कि अधिक मॉडल प्रणालियों isogenic जीवों के उपयोग से परे अपने अध्ययन का विस्तार कर रहे हैं विभिन्न जीनोटाइप शामिल करने के लिए10,16,20,21, इस विधि एक मूल्यवान संसाधन होगा शोधकर्ताओं को समझने की मांग कैसे प्रतियोगिता बहु तनाव या बहु प्रजातियों प्रणालियों को प्रभावित करता है.
Protocol
Representative Results
Discussion
ऊपर वर्णित coincubation परख interbactrial प्रतियोगिता की खोज करने के लिए एक शक्तिशाली विधि प्रदान करता है. इस दृष्टिकोण वी fischeri अलग और प्रतिस्पर्धी तंत्र की विशेषता के बीच intraspecific प्रतियोगिता की पहचान के लिए अनुमति दी<s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम समीक्षकों को उनकी सहायक प्रतिक्रिया के लिए धन्यवाद देना चाहते हैं. ए.एन.एस. गॉर्डन और बेटी मूर फाउंडेशन द्वारा अनुदान GBMF 255.03 के माध्यम से जीवन विज्ञान अनुसंधान फाउंडेशन के लिए समर्थित किया गया था.
Materials
| 1.5 mL Microcentrifuge Tubes | Fisher | 05-408-129 | |
| 10 μL multichannel pipette | |||
| 100 μL multichannel pipette | |||
| 300 μL multichannel pipette | |||
| 10 μL single channel pipette | |||
| 20 μL single channel pipette | |||
| 200 μL single channel pipette | |||
| 1000 μL single channel pipette | |||
| 24-well plates | Fisher | 07-200-84 | sterile with lid |
| 96-well plates | VWR | 10062-900 | sterile with lid |
| Calculator | |||
| Chloramphenicol | Sigma | C0378 | stock (20 mg/mL in Ethanol); final concentration in media (2 μg /mL LBS) |
| Fluorescence dissecting microscope with camera and imaging software | |||
| forceps | Fisher | 08-880 | |
| Kanamycin Sulfate | Fisher | BP906-5 | stock (100 mg/mL in water, filter sterilize); final concentration in media (1 μg/mL LBS) |
| Nitrocellulose membrane (FS MCE, 25MM, NS) | Fisher | SA1J788H5 | 0.22 μm nitrocellulose membrane (pk of 100) |
| petri plates | Fisher | FB0875713 | sterile with lid |
| Spectrophotometer | |||
| Semi-micro cuvettes | VWR | 97000-586 | |
| TipOne 0.1-10 μL starter system | USA Scientific | 1111-3500 | 10 racks |
| TipOne 200 μL starter system | USA Scientific | 1111-500 | 10 racks |
| TipOne 1000 μL starter system | USA Scientific | 1111-2520 | 10 racks |
| Vortex | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LBS media | |||
| 1M Tris Buffer (pH ~7.5) | 50 mL 1 M stock buffer (62 mL HCl, 938 mL DI water, 121 g Trizma Base) | ||
| Agar Technical | Fisher | DF0812-17-9 | 15 g (Add only for plates) |
| DI water | 950 mL | ||
| Sodium Chloride | Fisher | S640-3 | 20 g |
| Tryptone | Fisher | BP97265 | 10 g |
| Yeast Extract | Fisher | BP9727-2 | 5 g |
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