Summary

המשך הדגירה של האינטראקציה התחרותית בין vibrio פישרי מבודד

Published: July 22, 2019
doi:

Summary

חיידקים לקודד מנגנונים שונים לעוסקים בתחרות הבינחיידקית. כאן, אנו מציגים פרוטוקול המבוסס על תרבות לאפיון אינטראקציות תחרותיות בין מבודד חיידקי וכיצד הם משפיעים על המבנה המרחבי של אוכלוסיה מעורבת.

Abstract

כתב יד זה מתאר את היסוד המבוסס על תרבות, הדגירה לגילוי ואפיון של אינטראקציות תחרותיות בין שתי אוכלוסיות בקטריאלי. שיטה זו מעסיקה פלמידים יציבים המאפשרים לכל אוכלוסיה להיות מתויג באופן מובהק עם יכולות עמידות לאנטיביוטיקה ברורים וחלבונים פלורסנט לבחירה ואפליה חזותית של כל אוכלוסיה, בהתאמה. כאן, אנו מתארים את ההכנה ואת הדגירה של זנים vibrio פישרי מתחרה, הדמיה מיקרוסקופית פלואורסצנטית, וניתוח נתונים כמותיים. גישה זו פשוטה, התשואות תוצאות מהירות, וניתן להשתמש בה כדי לקבוע אם אוכלוסיה אחת הורגת או מעכבת את התפתחותם של אוכלוסיה אחרת, ואם התחרות מתווכת באמצעות מולקולה מפועלת או מחייבת מגע ישיר לתא הנייד. מכיוון שכל אוכלוסיית חיידקים מבטאת חלבון פלורסנט שונה, האבחנה מאפשרת אפליה מרחבית של אוכלוסיות מתחרות בתוך מושבה מעורבת. למרות השיטות המתוארות מתבצעות עם חיידק סימביוטי V. פישרי באמצעות התנאים אופטימיזציה עבור מין זה, הפרוטוקול יכול להיות מותאם לבודד בקטריאלי ביותר הניתנים לשימוש.

Introduction

כתב יד זה מתאר שיטה מבוססת-תרבות כדי לקבוע אם שני מבודד חיידקי מסוגלים לאינטראקציות תחרותיות. כאשר לומדים אוכלוסיות מעורבות, חשוב להעריך את המידה שבה החיידק מבודד את האינטראקציה, במיוחד אם מבודד מתחרים ישירות באמצעות מנגנוני הפרעה. תחרות ההפרעות מתייחסת לאינטראקציות שבהן אוכלוסיה אחת מעכבת באופן ישיר את הצמיחה או הורגת אוכלוסיית מתחרה1. אינטראקציות אלה חשובות לזיהוי מכיוון שהן יכולות להיות בעלת השפעה מעמיקה על מבנה הקהילה ותפקודו של מיקרוביאלית2,3.

מנגנונים לתחרות מיקרוביאלית התגלו באופן נרחב בתוך גנום של חיידקים מסביבות מגוונות, כולל שני מארחים הקשורים וחיידקים חיים חופשיים4,5,6,7, 8,9. מגוון אסטרטגיות תחרות תוארו10,11 כולל מנגנונים המפזרים, כגון כימיקלים בקטרידקים1,12 ו מופרש פפטידים מיקרוביאלית13 , כמו גם מנגנונים תלויי-קשר המחייבים יצירת קשר עם תא תא להעברת מעכבות אפקטור לתאי יעד9,14,15,16,17 ,בן 18

למרות שcoincubations המבוסס על תרבות משתמשים בדרך כלל במיקרוביולוגיה5,8,19, כתב היד הזה מתאר כיצד להשתמש באפשרות לאפיין את מנגנון התחרות, כמו גם הצעות להתאמת הפרוטוקול לשימוש עם מינים חיידקיים אחרים. יתרה מזאת, שיטה זו מתארת גישות מרובות לניתוח ולהצגת הנתונים כדי לענות על שאלות שונות אודות אופי האינטראקציות התחרותיות. למרות הטכניקות המתוארות כאן היו בשימוש בעבר כדי לזהות את מנגנון ההרג הבינקטקטריאלי בבסיס התחרות הפנים מסוים בין זנים שיתופי של חיידקים vibrio פישרי מבודדים19, הם מתאימים מינים חיידקיים רבים, כולל מבודד סביבתי ופתוגנים אנושיים, ויכולים להיות מנוצלים להערכת מנגנונים תחרותיים תלויי-מגע ומפזרים. שלבים בפרוטוקול עשויים לדרוש אופטימיזציה של מינים חיידקיים אחרים. בהינתן כי מערכות מודל יותר מרחיבים את המחקרים שלהם מעבר לשימוש של אורגניזמים איזוגניים לכלול גנוטיפים שונים10,16,20,21, שיטה זו תהיה משאב חשוב לחוקרים המבקשים להבין כיצד התחרות משפיעה על מערכות מרובות זנים או רב מינים.

Protocol

1. להכין זנים עבור Coincubation לבחור זן התייחסות מתאים שישמש כיעד לתחרות חיידקים במהלך שיטת הדגירה. ראה דיון לגבי שיטות עבודה מומלצות בעת בחירת זן הפניה וכיצד מאמץ ההפניה ישפיע על התוצאות. בפרוטוקול זה, V. פישרי זן ES114 ישמש זן התייחסות. קביעת הבחירה ושיטות ההקרנה ישמ?…

Representative Results

על מנת להעריך את האינטראקציות התחרותיות בין אוכלוסיות בקטריאליות, פרוטוקול שיטת הדגירה פותח וממוטב עבור V. פישרי. שיטה זו משתמשת פלמידים יציבים לקודד גנים עמידות לאנטיביוטיקה וחלבונים פלורסנט, המאפשר בחירה דיפרנציאלית ואפליה חזותית של כל זן. על-ידי ניתוח הנתונים שנ…

Discussion

שיטת הדגירה שתוארה לעיל מספקת שיטה רבת-עוצמה לגילוי תחרות בין-חיידקית. גישה זו אפשרה לזיהוי של התחרות התוך ספציפי בין V. פישרי מבודד ואפיון של מנגנון תחרותי19. למרות השיטה שתוארה היה אופטימיזציה עבור החיידק הימי V. פישרי, זה יכול להיות שונה בקלות כדי להכיל מינים חיידקי?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

ברצוני להודות לבודקים על המשוב המועיל שלהם. A.N.S. היתה נתמכת על ידי קרן גורדון ובטי מור באמצעות גרנט GBMF 255.03 לקרן המחקר למדעי החיים.

Materials

1.5 mL Microcentrifuge Tubes Fisher 05-408-129
10 μL multichannel pipette
100 μL multichannel pipette
300 μL multichannel pipette
10 μL single channel pipette
20 μL single channel pipette
200 μL single channel pipette
1000 μL single channel pipette
24-well plates Fisher 07-200-84 sterile with lid
96-well plates VWR 10062-900 sterile with lid
Calculator
Chloramphenicol Sigma C0378 stock (20 mg/mL in Ethanol); final concentration in media (2 μg /mL LBS)
Fluorescence dissecting microscope with camera and imaging software
forceps Fisher 08-880
Kanamycin Sulfate Fisher BP906-5 stock (100 mg/mL in water, filter sterilize); final concentration in media (1 μg/mL LBS)
Nitrocellulose membrane (FS MCE, 25MM, NS) Fisher SA1J788H5 0.22 μm nitrocellulose membrane (pk of 100)
petri plates Fisher FB0875713 sterile with lid
Spectrophotometer
Semi-micro cuvettes VWR 97000-586
TipOne 0.1-10 μL starter system USA Scientific 1111-3500 10 racks
TipOne 200 μL starter system USA Scientific 1111-500 10 racks
TipOne 1000 μL starter system USA Scientific 1111-2520 10 racks
Vortex
Name Company Catalog Number Comments
LBS media
1M Tris Buffer (pH ~7.5) 50 mL 1 M stock buffer (62 mL HCl, 938 mL DI water, 121 g Trizma Base)
Agar Technical Fisher DF0812-17-9 15 g (Add only for plates)
DI water 950 mL
Sodium Chloride Fisher S640-3 20 g
Tryptone Fisher BP97265 10 g
Yeast Extract Fisher BP9727-2 5 g

References

  1. Hibbing, M. E., Fuqua, C., Parsek, M. R., Peterson, S. B. Bacterial competition: surviving and thriving in the microbial jungle. Nature Reviews Microbiology. 8 (1), 15-25 (2010).
  2. Nyholm, S. V., McFall-Ngai, M. The winnowing: establishing the squid-Vibrio symbiosis. Nature Reviews Microbiology. 2 (8), 632-642 (2004).
  3. Dörr, N. C. D., Blockesh, M. Bacterial type VI secretion system facilitates niche domination. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (36), 8855-8857 (2018).
  4. Maclntyre, D. L., Miyata, S. T., Kitaoka, M., Pukatzki, S. The Vibrio cholerae type VI secretion system displays antimicrobial properties. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (45), 19520-19524 (2010).
  5. Salomon, D., Gonzalez, H., Updegraff, B. L., Orth, K. Vibrio parahaemolyticus type VI secretion system 1 is activated in marine conditions to target bacteria, and is differentially regulated from system 2. PloS One. 8 (4), e61086 (2013).
  6. Sana, T. G., et al. Salmonella Typhimurium utilizes a T6SS-mediated antibacterial weapon to establish in the host gut. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (34), E5044-E5051 (2016).
  7. Schwarz, S., et al. Burkholderia type VI secretion systems have distinct roles in eukaryotic and bacterial cell interactions. PLoS Pathogens. 6 (8), e1001068 (2010).
  8. Wenren, L. M., Sullivan, N. L., Cardarelli, L., Septer, A. N., Gibbs, K. A. Two independent pathways for self-recognition in Proteus mirabilis are linked by type VI-dependent export. MBio. 4 (4), (2013).
  9. García-Bayona, L., Guo, M. S., Laub, M. T. J. E. Contact-dependent killing by Caulobacter crescentus via cell surface-associated, glycine zipper proteins. Elife. 6, 24869 (2017).
  10. Stubbendieck, R. M., Straight, P. D. Multifaceted interfaces of bacterial competition. Journal of bacteriology. 198 (16), 2145-2155 (2016).
  11. Cornforth, D. M., Foster, K. R. Antibiotics and the art of bacterial war. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (35), 10827-10828 (2015).
  12. Shank, E. A., Kolter, R. New developments in microbial interspecies signaling. Current Opinion in Microbiology. 12 (2), 205-214 (2009).
  13. Roelofs, K. G., Coyne, M. J., Gentyala, R. R., Chatzidaki-Livanis, M., Comstock, L. E. Bacteroidales secreted antimicrobial proteins target surface molecules necessary for gut colonization and mediate competition in vivo. MBio. 7 (4), e01055-e01016 (2016).
  14. Dey, A., Vassallo, C. N., Conklin, A. C., Pathak, D. T., Troselj, V., Wall, D. Sibling rivalry in Myxococcus xanthus is mediated by kin recognition and a polyploid prophage. Journal of bacteriology. 198 (6), (2016).
  15. Danka, E. S., Garcia, E. C., Cotter, P. A. Are CDI systems multicolored, facultative, helping greenbeards?. Trends in Microbiology. 25 (5), 391-401 (2017).
  16. Willett, J. L., Ruhe, Z. C., Coulding, C. W., Low, D. A., Hayes, C. S. Contact-dependent growth inhibition (CDI) and CdiB/CdiA two-partner secretion proteins. Journal of molecular biology. 427 (23), 3754-3765 (2015).
  17. Cianfanelli, F. R., Monlezun, L., Coulthurst, S. J. Aim, load, fire: the type VI secretion system, a bacterial nanoweapon. Trends in Microbiology. 24 (1), 51-62 (2016).
  18. Joshi, A., Kostiuk, B., Rogers, A., Teschler, J., Pukatzki, S., Yildiz, F. H. Rules of engagement: the type VI secretion system in Vibrio cholerae. Trends in microbiology. 25 (4), 267-279 (2017).
  19. Speare, L., et al. Bacterial symbionts use a type VI secretion system to eliminate competitors in their natural host. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (36), E8528-E8537 (2018).
  20. Shank, E. A. Using coculture to detect chemically mediated interspecies interactions. Journal of Visualized Experiments. (80), (2013).
  21. Long, R. A., Rowley, D. C., Zamora, E., Liu, J., Bartlett, D. H., Azam, F. Antagonistic interactions among marine bacteria impede the proliferation of Vibrio cholerae. Applied and Environmental Microbiology. 71 (12), 8531-8536 (2005).
  22. Dunn, A. K., Millikan, D. S., Adin, D. M., Bose, J. L., Stabb, E. V. New rfp-and pES213-derived tools for analyzing symbiotic Vibrio fischeri reveal patterns of infection and lux expression in situ. Applied and Environmental Microbiology. 72 (1), 802-810 (2006).
  23. Sana, T. G., et al. The second type VI secretion system of Pseudomonas aeruginosa strain PAO1 is regulated by quorum sensing and Fur and modulates internalization in epithelial cells. Journal of Biological Chemistry. 287 (32), 27095-27105 (2012).
  24. Bachmann, V., Kostiuk, B., Unterweger, D., Diaz-Satizabal, L., Ogg, S., Pukatzki, S. Bile salts modulate the mucin-activated type VI secretion system of pandemic Vibrio cholerae. PLoS. 9 (8), e0004031 (2015).
  25. Ishikawa, T., Rompikuntal, P. K., Lindmark, B., Milton, D. L., Wai, S. N. Quorum sensing regulation of the two hcp alleles in Vibrio cholerae O1 strains. PloS One. 4 (8), e6734 (2009).
  26. Ishikawa, T., et al. Pathoadaptive conditional regulation of the type VI secretion system in Vibrio cholerae O1 strains. Infection and immunity. 80 (2), 575-584 (2012).
  27. Pollack-Berti, A., Wollenberg, M. S., Ruby, E. G. Natural transformation of Vibrio fischeri requires tfoX and tfoY. Environmental Microbiology. 12 (8), 2302-2311 (2010).
  28. Meibom, K. L., Blockesh, M., Dolganov, N. A., Wu, C. Y., Schoolnik, G. K. Chitin induces natural competence in Vibrio cholerae. Science. 310 (5755), 1824-1827 (2005).
  29. Borgeaud, S., Metzger, L. C., Scrignari, T., Blockesh, M. The type VI secretion system of Vibrio cholerae fosters horizontal gene transfer. Science. 347 (6217), 63-67 (2015).
  30. Townsley, L., Mangus, M. P. S., Mehic, S., Yildiz, F. H. Response of Vibrio cholerae to low-temperature shift: CpsV regulates type VI secretion, biofilm formation, and association with zooplankton. Applied and Environmental Microbiology. 82 (14), 00807-00816 (2016).
  31. Huang, Y., et al. Functional characterization and conditional regulation of the type VI secretion system in Vibrio fluvialis. Frontiers in microbiology. 8, 528 (2017).

Play Video

Cite This Article
Speare, L., Septer, A. N. Coincubation Assay for Quantifying Competitive Interactions between Vibrio fischeri Isolates. J. Vis. Exp. (149), e59759, doi:10.3791/59759 (2019).

View Video