Génération de neurosphères à partir de neurones hippocampes et corticales primaires mixtes isolées de l'embryon de rat Sprague Dawley E14-E16

Summary

Présenté ici est un protocole pour la génération spontanée de neurosphères enrichies dans les cellules progénitrices neurales des neurones plaqués de haute densité. Au cours de la même expérience, lorsque les neurones sont plaqués à une densité plus faible, le protocole entraîne également des cultures de neurones de rat primaire prolongées.

Abstract

La culture neuronale primaire est une technique essentielle dans le domaine des neurosciences. Pour obtenir des connaissances mécanistes plus approfondies dans le cerveau, il est essentiel d’avoir un modèle in vitro robuste qui peut être exploité pour diverses études de neurobiologie. Bien que les cultures neuronales primaires (c.-à-d., les cultures hippocampales à long terme) aient fourni aux scientifiques des modèles, il ne représente pas encore complètement la complexité du réseau cérébral. Dans le sillage de ces limitations, un nouveau modèle a émergé en utilisant des neurosphères, qui ressemble plus étroitement au tissu cérébral. Le protocole actuel décrit le placage des densités élevées et basses des neurones corticaux et hippocampal mélangés isolés de l’embryon des rats embryonnaires de jour 14-16 de Sprague Dawley. Cela permet la génération de neurosphères et la culture neuronale primaire à long terme comme deux plates-formes indépendantes pour mener d’autres études. Ce processus est extrêmement simple et rentable, car il minimise plusieurs étapes et réactifs précédemment jugés essentiels pour la culture neuronale. Il s’agit d’un protocole robuste avec des exigences minimales qui peuvent être effectuées avec des résultats réalisables et encore utilisé pour une diversité d’études liées aux neurosciences.

Introduction

Le cerveau est un circuit complexe de cellules neuronales et non neuronales. Pendant des années, les scientifiques ont essayé d’obtenir un aperçu de cette machinerie complexe. Pour ce faire, les neuroscientifiques ont d’abord eu recours à diverses lignées cellulaires à base de nerfs transformées pour des enquêtes. Cependant, l’incapacité de ces lignées cellulaires clonales à former de fortes connexions synaptiques et des axones ou dendrites appropriés ont déplacé l’intérêt scientifique vers les cultures neuronales primaires^1,2. L’aspect le plus excitant de la culture neuronale primaire est qu’il crée une occasion d’observer et de manipuler les neurones vivants³. En outre, il est moins complexe par rapport au tissu neural, ce qui en fait un candidat idéal pour étudier la fonction et le transport de diverses protéines neuronales. Récemment, plusieurs développements dans les domaines de la microscopie, de la génomique et de la protéomique ont généré de nouvelles opportunités pour les neuroscientifiques d’exploiter les cultures neuronales⁴.

Les cultures primaires ont permis aux neuroscientifiques d’explorer les mécanismes moléculaires derrière le développement neuronal, d’analyser diverses voies de signalisation neuronale et de développer une compréhension plus cohérente de la synapse. Bien qu’un certain nombre de méthodes aient rapporté des cultures des neurones primaires (principalement de l’origine hippocampique^5,6,7), un protocole unifié avec un milieu chimiquement défini qui permet la culture à long terme des neurones est encore nécessaire. Cependant, les neurones plaqués à une faible densité sont le plus souvent observés, qui ne survivent pas à long terme, probablement en raison du manque de soutien trophique⁸ qui est fourni par les neurones adjacents et les cellules gliales. Certaines méthodes ont même suggéré la co-culture des neurones primaires avec des cellules gliales, dans laquelle les cellules gliales sont utilisées comme couche d’alimentation⁹. Cependant, les cellules gliales posent beaucoup de problèmes en raison de leur surcroissance, qui l’emportent parfois sur la croissance neuronale¹⁰. Par conséquent, compte tenu des problèmes ci-dessus, un protocole de culture neuronale primaire plus simple et plus rentable est nécessaire, qui peut être utilisé par les neurobiologistes et les neurochimistes pour les enquêtes.

Une culture neuronale primaire est essentiellement une forme de culture 2D et ne représente pas la plasticité, l’intégrité spatiale ou l’hétérogénéité du cerveau. Cela a donné lieu à la nécessité d’un modèle 3D plus crédible appelé neurosphères^11,12. Les neurosphères présentent une nouvelle plate-forme aux neuroscientifiques, avec une ressemblance plus étroite avec le cerveau réel, in vivo¹³. Les neurosphères sont des grappes 3D non adhérentes de cellules riches en cellules souches neurales (NSC), en cellules progénitrices neurales (NPC), neurones et astrocytes. Ils sont une excellente source pour l’isolement des cellules souches neurales et des cellules progénitrices neurales, qui peuvent être utilisées pour étudier la différenciation en diverses lignées neuronales et non neuronales. Encore une fois, la variabilité au sein des cultures de neurosphère produite à l’aide des protocoles précédemment rapportés présente un obstacle à la formulation d’un protocole unifié de culture de neurosphère¹⁴.

Ce manuscrit présente un protocole dans lequel il est possible de générer des plates-formes 2D et 3D en alternant les densités de placage cellulaire à partir d’une culture corticale et hippocampal mixte. On observe que dans un délai de 7 jours, des neurosphères flottantes sont obtenues à partir de neurones plaqués à haute densité isolés de l’embryon de rat E14-E16 Sprague Dawley, qui, sur une autre culture, forment des ponts et des interconnexions par des extensions gliales radiaux. De même, dans les neurones plaqués de faible densité, une culture neuronale primaire qui peut être maintenue jusqu’à 30 jours est obtenue en changeant le milieu d’entretien deux fois par semaine.

Protocol

Toutes les procédures expérimentales impliquant des animaux ont été approuvées par le Comité d’éthique animale institutionnelle du CSIR-Indian Institute of Chemical Biology (IICB/AEC/Meeting/Apr/2018/1). 1. Réagent et préparation des médias Solution de poly-d-lysine (PDL) : préparer des solutions PDL à des concentrations de 0,1 mg/mL dans de l’eau déionisée et stocker à 4 oC jusqu’à utilisation. Moyen de dissociation : À 1 L d’eau déionisée stérile et fi…

Representative Results

Dans ce protocole, une stratégie simple a été élucidée dans laquelle des densités variables de placage cellulaire de deux plates-formes différentes de criblage neural sont obtenues. Figure 1A,B illustre l’adhérence des cellules après 4 h de placage des neurones dans les cellules plaquées à haute et faible densité, respectivement. En observant la bonne adhérence des neurones comme indiqué à la figure 1</stro…

Discussion

Ce protocole décrit comment en modifiant les densités de placage cellulaire des neurones primaires, deux plates-formes neuronales variables sont obtenues. Bien qu’il s’agisse d’une méthode simple, chaque étape doit être méticuleusement effectuée pour obtenir les résultats souhaités. D’autres méthodes précédentes ont rapporté des cultures primaires à long terme de neurone ou des cultures de neurosphère. La plupart des protocoles de culture neuronale primaire ont impliqué la culture des neurones hippocampiq…

Materials

Anti-GFAP	Abcam	AB7260
Anti- Nestin	Abcam	AB92391
Anti-O4	Millipore	MAB345
Anti-Tau	Abcam	AB76128
Anti-Tuj1	Millipore	MAB1637
B27 Serum Free Supplement	Gibco	17504-044
Cell Counter	Life technologies	Countess II FL
CO2 Incubator	Eppendorf	Galaxy 170 R
D-glucose	SDFCL	38450-K05
Ethanol	Merck Millipore	100983
Fluorescence Microscope	Olympus	IX83 Model
Formaldehyde	Sigma Aldrich	47608
GlutaMax-I Supplement	Gibco	35050-061
GtXMs IgG Fluor	Millipore	AP1814
GtXMs IgG (H+L)	Millipore	AP124C
HEPES	SRL	16826
Hoechst 33258	Calbiochem	382061
Horse Serum	HiMedia	RM10674
Hydrochloric Acid	Rankem	H0100
Laminar Hood	BioBase	BBS-V1800
MEM Eagle’s with Earle’s BSS	Sigma Aldrich	M-2279
Microscope	Dewinter	Victory Model
Neurobasal Medium	Gibco	21103-049
Plasticware (24 well plate, cell strainers, and low adherence plates)	BD Falcon	353047, 352350 and 3471
90 mm Petridishes	Himedia	PW001
Penicillin/Streptomycin	Gibco	15140-122
Poly-D-Lysine	Millipore	A.003.E
Potassium Chloride	Fisher Scientific	BP366-500
Potassium Phosphate Monobasic	Merck	MI6M562401
Sodium Chloride	Qualigem	15918
Sodium Phosphate Dibasic	Merck	MI6M562328
Stereomicrosope	Dewinter	Zoomstar Model
Triton-X 100	SRL	2020130
Trypan Blue Solution	Gibco	15250-061
0.25 % Trypsin-EDTA	Gibco	25200-072