Le but de cette méthode est de générer des cellules progénitrices cardiaques spécifiques au champ cardiaque in vitro afin d'étudier la spécification des cellules progénitrices et les propriétés fonctionnelles, et de générer des cellules cardiaques spécifiques à la chambre pour la modélisation des maladies cardiaques.
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Article de méthode
In Vitro Generation of Mouse Heart Field-specific Cardiac Progenitor Cells In Vitro Generation of Mouse Heart Field-specific Cardiac Progenitor Cells In Vitro Generation of Mouse Heart Field-specific Cardiac Progenitor Cells In Vitro
Dans cet article
Résumé
Résumé
Les cellules souches pluripotentes offrent un grand potentiel pour comprendre le développement cardiaque et la maladie et pour la médecine régénérative. Bien que les progrès récents de la cardiologie développementale aient conduit à la production de cellules cardiaques à partir de cellules souches pluripotentes, on ne sait pas si les deux champs cardiaques - les premier et deuxième champs cardiaques (FHF et SHF) - sont induits dans les systèmes de cellules souches pluripotentes. Pour remédier à cette situation, nous avons généré un protocole de spécification in vitro et d'isolement des cellules progénitrices cardiaques spécifiques au champ cardiaque. Nous avons utilisé des lignées de cellules souches embryonnaires transportant Hcn4-GFP et Tbx1-Cre; Rosa-RFP reporters de la FHF et le SHF, respectivement, et immunostaining cellulaire séminueux vivant de la protéine de membrane cellulaire Cxcr4, un marqueur SHF. Avec cette approche, nous avons généré des cellules progénitrices qui récapitulent les propriétés fonctionnelles et le transcriptome de leurs homologues in vivo. Notre protocole peut être utilisé pour étudier la spécification précoce et la ségrégation des deux champs cardiaques et pour générer des cellules cardiaques spécifiques à la chambre pour la modélisation des maladies cardiaques. Puisqu'il s'agit d'un système organoïde in vitro, il peut ne pas fournir d'informations anatomiques précises. Cependant, ce système surmonte la faible accessibilité des embryons au stade de la gaztrulation et peut être mis à niveau pour les écrans à haut débit.
Introduction
L'utilisation de cellules souches pluripotentes (CSP) a révolutionné le domaine de la régénération cardiaque et de la médecine personnalisée avec des myocytes spécifiques aux patients pour la modélisation des maladies et les pharmacothérapies1,2,3, 4. Plus récemment, des protocoles in vitro pour la génération de cardiomyocytes auriculaires vs ventriculaires ainsi que des stimulateurs cardiaques dérivés de PSC ont été développés5,6. Cependant, si la cardiogenèse peut être recréée in v....
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Protocole
REMARQUE: Génération in vitro de cellules progénitrices cardiaques spécifiques au champ cardiaque (Figure 1).
1. Entretien des ESC de souris
- Cultivez des MESC (mESCtbtb-Cre; Rosa-RFP; HCN4-GFP, mESCIsl1-RFP)25 sur 0,1% (w/v) flasque t25 enrobée de 2i medium (870 mL de milieu essentiel minimum de glascow (GMEM), 100 mL de sérum bovin fœtal (FBS), 10 mL de GlutaMAX, 10 mL d'acides aminés non essentiels, 10 mL de sodium pyruvate, 3 l de bêta-mercaptoéthanol, 20 oL de Lif (200 U/mL), 0,3 M CHIR99021 et 0,1 M PD0325901). ....
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Résultats
Après environ 132 h de différenciation, les CCP Tbx1-RFP et Hcn4-GFP peuvent être détectés à l'aide d'un microscope fluorescent (figure2). En général, les cellules GFP et DFP apparaissent à peu près à la même époque. Les deux populations de CPC continuent de croître à proximité et généralement dans un schéma complémentaire. L'ajustement des concentrations d'Activin A et de BMP4 modifiera les pourcentages de CPC FHF vs SHF (figure 3). La spécification de CPC in v.......
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Discussion
Dans notre protocole, nous décrivons une méthodologie pour produire des sphéroïdes cardiaques et des CPC isolés spécifiques au champ cardiaque. Ceux-ci peuvent être utilisés pour étudier les mécanismes de spécification scPC et leurs propriétés, ainsi que pour la modélisation des maladies spécifiques à la chambre cardiaque. Un travail précédemment édité a employé une ligne de MESC avec deux journalistes fluorescents (Mef2c/Nkx2.5) pour étudier la cardiogenèse in vitro, cependant, ces deux marqueurs sont exprimés au jour e.......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n'ont rien pour les divulgations.
Remerciements
E. T. a été soutenu par The Magic That Matters et AHA. C. K. a reçu l'appui de subventions du NICHD/NIH (R01HD086026), de l'AHA et du MSCRF.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| &beta ;-mercaptoéthanol | Sigma | M6250 | |
| 0,1 % (p/v) Gélatine | EMD Millipore | ES-006-B | |
| 100 mM Pyruvate de sodium | Gibco | 11360 | |
| 100x Pen/Strep | Gibco | 15070-063 | |
| 1x PBS sans calcium et magnésium | Thermo Fisher Scientific | 21-040-CV | |
| 20 % Paraformaldéhyde | Thermo Fisher Scientific | 50-980-493 | |
| 5 mL Tube à fond rond en polystyrène avec un 40&mu ; crépine à cellules m | BD Falcon | 35223 | |
| Activin A | R & D Systems | 338-AC-010 | |
| Acide ascorbique | Sigma | A-4544 | |
| B27 moins vitamine A (50x) | Thermo Fisher Scientific | 12587010 | |
| BMP4 | R & D Systems | 314-BP | |
| Sérum bovin Albumine | Sigma | A2153 | |
| Trieur de cellules | Sony | SH800 | Sony ou tout autre trieur de cellules activées par fluorescence |
| Passoire de cellules 70&mu ; m | Thermo Fisher Scientific | 08-771-2 | |
| Centrifugeuse Sorvall Legend XT | Thermo Fisher Scientific | 75004508 | |
| CHIR99021 | Selleck chemicals | S2924 | |
| CO2 Incubateur | Thermo Fisher Scientific | 51030285 | |
| Corning Gourde T75 Ultra Low Attachment | Corning | 07-200-875 | |
| D’innombrables compteurs de cellules automatisés II FL | Thermo Fisher Scientific | ||
| Donkey anti-souris IgG secondaire, conjugué Alexa Fluor 647 | Thermo Fisher Scientific | A-31571, Lot #1757130 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium high glucose (DMEM) | Gibco | 11965-092 | |
| EDTA | Sigma | E6758 | |
| ESGRO (LIF) | Microscope Millipore | ESG1106 | |
| EVOS FL | Thermo Fisher Scientific | AMF4300 | |
| Sérum de veau fœtal | Invitrogen | SH30071.03 | |
| Glasgow' s MEM (GMEM) | Gibco | 11710035 | |
| GlutaMAX (100x) | Gibco | 35050-061 | |
| Jambon' s F12 | Gibco | 10-080-CV | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| IMDM | Gibco | 12440053 | |
| Monothioglycero (MTG) | Sigma | M-6145 | |
| Anticorps anti-troponine T de souris | Thermo Fisher Scientific | MS-295-P1 | |
| N2-SUPPLEMENT | Gibco | 17502-048 | |
| Non essentiel solution d’acides aminés (NEAA | Invitrogen | 11140-050 | |
| PD0325901 | Selleckchem | S1036 | |
| PerCP-efluor 710 Anticorps conjugué anti-Cxcr4 | Thermo Fisher Scientific | 46-9991-82 | |
| Boîte de culture en suspension 150 mm x 25 mm | Corning | 430597 | |
| T25 flacons | Corning | 353109 | |
| TrypLE (Trypsine) | Gibco | 12604 | |
| Y-27632 (inhibiteur de ROCK) | Technologies des cellules souches | 72304 |
Références
- Laflamme, M. A., Murray, C. E. Heart regeneration. Nature. 473 (7347), 326-335 (2011).
- Spater, D., Hansson, E. M., Zangi, L., Chien, K. R. How to make a cardiomyocyte. Development. 141 (23), 4418-4431 (2014).
- Birket, M. J., Mummery, C. L.
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Réimpressions et autorisations
