En protokol til at forberede fritflydende skive kulturer fra voksne menneskelige hjerne er præsenteret. Protokollen er en variation af den udbredte skive kultur metode ved hjælp af membran skær. Det er simpelt, omkostningseffektivt, og anbefales til at kørekort sigtede assays sigter mod at opklare mekanismer af neurodegeneration bag aldersrelaterede hjernesygdomme.
Organotypiske, eller skive kulturer, er blevet bredt anvendt til at modellere aspekter af det centrale nervesystem fungerer in vitro. På trods af potentialet i Skive kulturer i neurovidenskab, undersøgelser ved hjælp af voksne nervevæv til at forberede sådanne kulturer er stadig knappe, især dem fra menneskelige. Brugen af voksne menneskelige væv til at forberede skive kulturer er særligt attraktivt at forbedre forståelsen af humane neuropatiologier, da de har unikke egenskaber typisk for den modne menneskelige hjerne mangler i skiver fremstillet af gnaver (normalt neonatal) nervevæv. Denne protokol beskriver, hvordan man bruger hjernevæv indsamlet fra levende menneskelige donorer indsendt til resective hjernekirurgi til at forberede kortsigtede, fritflydende skive kulturer. Procedurer til at vedligeholde og udføre biokemiske og cellebiologi assays ved hjælp af disse kulturer er også præsenteret. Repræsentative resultater viser, at den typiske humane kortikale laminering bevares i skiver efter 4 dage in vitro (DIV4), med forventet tilstedeværelse af de vigtigste neurale celletyper. Desuden, skiver på DIV4 undergår robust celledød, når udfordret med en giftig stimulus (H2O2), hvilket indikerer potentialet i denne model til at fungere som en platform i celledød assays. Denne metode, et enklere og omkostningseffektivt alternativ til den udbredte protokol ved hjælp af membran skær, anbefales primært til at kørekort varige assays, der har til formål at opklare mekanismer af neurodegeneration bag aldersrelaterede hjernesygdomme. Endelig, selv om protokollen er afsat til anvendelse af kortikale væv indsamlet fra patienter indsendt til kirurgisk behandling af farmakoresistant temporale lobe epilepsi, det hævdes, at væv indsamlet fra andre hjerneregioner/betingelser bør også være betragtes som kilder til at producere lignende fritflydende udsnit kulturer.
Brugen af humane prøver i forskning er utvetydigt en stor mulighed for at studere menneskelige hjerne patologier, og moderne teknikker har åbnet nye måder for robuste og etiske eksperimenter ved hjælp af patient-afledte væv. Metoder som organotypic/skive kulturer fremstillet af voksne menneskelige hjerne er blevet mere og mere anvendt i paradigmer såsom optogenetik1, Elektrofysiologi2,3,4,5, plasticitet 6,7,8,9, neurotoksicitet/neuroprotection10,11,12,13, celleterapi14, Drug screening15,16,17, genetik og genredigering12,18,19,20, blandt andre, som en strategi for bedre at forstå neurologiske sygdomme i voksenalderen.
Forståelsen af mekanismer underliggende menneskelige hjerne patologier afhænger af eksperimentelle strategier, der kræver et stort antal emner. Omvendt, i tilfælde af skive kulturer, selv om adgang til humane prøver stadig er vanskelig, muligheden for at generere op til 50 skiver fra en enkelt kortikal prøve delvist omgår kravet om rekruttering af flere frivillige ved at øge antal replikater og udførte assays pr. indsamlet væv21.
Flere protokoller for hjernen organotypic/skive kulturer er blevet beskrevet, spænder fra den klassiske oculo udkast22,23 til rullerør24,25,26, semi-permeable membraner grænseflade27,28,29,30og fritflydende udsnit31,32. Afhængigt af de særlige forhold i et eksperimentelt design, hver teknik har sine egne fordele og ulemper. Kortvarige, fritflydende skiver kulturer fra voksne menneskelige hjerner er i nogle tilfælde fordelagtige over den metode, der anvendes af Stoppini et al.27, hvis man tager i betragtning, at selv om langvarig celle overlevelse in vitro normalt er et stort problem, når man evaluerer en kultur metode, i mange eksperimenter kun korte perioder af tid i kulturen er nødvendige12,31,32,33,34,35. Under disse betingelser, brugen af fritflydende kulturer præsenterer fordelen ved at være enklere og mere omkostningseffektiv, samt mere præcist ligner den oprindelige menneskelige væv tilstand end skiver holdes i kulturen over 2-3 uger.
På trods af potentialet i Skive kulturer til neurovidenskab, er undersøgelser ved hjælp af voksne nervevæv til at forberede sådanne kulturer stadig knappe, især fra menneskelige. Denne artikel beskriver en protokol til at bruge indsamlede hjernevæv fra levende menneskelige donorer indsendt til resective hjernekirurgi til at forberede fritflydende skive kulturer. Procedurer til at vedligeholde og udføre biokemiske og cellebiologi assays ved hjælp af disse kulturer er detaljerede. Denne protokol er blevet bevist værdifuld for at analysere levedygtighed og neuronal funktion i undersøgelser af mekanismerne i neuropatiologier knyttet til voksenalderen.
Denne protokol til produktion af fritflydende, kortvarige skive kulturer er en alternativ metode til dyrkning af voksne menneskelige neortikale skiver. En sådan protokol for skive kulturer kan være modtagelig for undersøgelser af (men ikke begrænset til) optogenetik1,44,45, Elektrofysiologi2,3,4,5 …
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde understøttes af FAPESP (Grant 25681-3/2017 to AS), CAPES (post-doktor Fellowship PNPD/INCT-HSM til A.F. og præ-doktor stipendiat til N.D.M.) og FAEPA. G.M.A. har en Master’s Fellowship fra FAPESP (MS 2018/06614-4). N.G.C. besidder et CNPq Research Fellowship. Vi takker patienterne og deres familier for at donere det viderekomne væv til denne undersøgelse. Vi vil gerne anerkende støtte fra beboere, sygeplejersker, teknikere og CIREP team, fra det kliniske Hospital på Ribeirão Preto Medical School, University of São Paulo, der hjalp i forskellige stadier af processen.
2-Propanol | Merck | 1096341000 | |
Acrylamide/Bis-Acrylamide, 30% solution | Sigma Aldrich | A3449 | |
Agarose | Sigma Aldrich | A9539 | |
Ammonium persulfate | Sigma | A3678-25G | |
Amphotericin B | Gibco | 15290-018 | |
Antibody anti-ERK 2 (rabbit) | Santa Cruz Biotecnology | sc-154 | Dilution 1:1,000 in BSA 2.5% |
Antibody anti-pERK (mouse) | Santa Cruz Biotecnology | sc-7383 | Dilution 1:1,000 in BSA 2.5% |
B27 | Gibco | 17504-044 | |
BDNF | Sigma Aldrich | SRP3014 | |
Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A7906 | |
Bradford 1x Dye Reagent | BioRad | 500-0205 | |
EDTA | Sigma | T3924 | Used in RIPA buffer |
Glucose | Merck | 108337 | |
Glutamax | Gibco | 35050-061 | |
Hank's Balanced Salts | Sigma Aldrich | H1387-10X1L | |
Hepes | Sigma Aldrich | H4034 | |
Hydrochloric acid | Merck | 1003171000 | |
Hydrogen Peroxide (H2O2) | Vetec | 194 | |
Mouse IgG, HRP-linked whole Ab (anti-mouse) | GE | NA931-1ML | |
NaCl | Merck | 1064041000 | Used in RIPA buffer |
Neurobasal A | Gibco | 10888-022 | |
Non-fat dry milk (Molico) | Nestlé | Used for membrane blocking | |
PBS Buffer pH 7,2 | Laborclin | 590338 | |
Penicilin/Streptomicin | Sigma Aldrich | P4333 | |
Potassium Chloride | Merck | 1049361000 | |
Prime Western Blotting Detection Reagent | GE | RPN2232 | |
Rabbit IgG, HRP-linked whole Ab (anti-rabbit) | GE | NA934-1ML | |
SDS | Sigma | L5750 | Used in RIPA buffer |
TEMED | GE | 17-1312-01 | |
Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide (MTT) | Sigma Aldrich | M5655 | |
Tris | Sigma | T-1378 | Used in RIPA buffer |
Triton x-100 | Sigma | X100 | Used in RIPA buffer |
Ultrapure Water | Millipore | Sterile water, derived from MiliQ water purification system | |
Equipment and Material | |||
24-well plates | Corning | CL S3526 | Flat Bottom with Lid |
Amersham Potran Premium (nitrocellulose membrane) | GE | 29047575 | |
Carbogen Mixture | White Martins | 95% O2, 5% CO2 | |
CO2 incubator | New Brunswick Scientific | CO-24 | Incubation of slices 5% CO2, 36ºC |
Microplate Reader | Molecular Devices | ||
Microtubes | Greiner | 001608 | 1,5mL microtube |
Motorized pestle | Kimble Chase | ||
Plastic spoon | Size of a dessert spoon | ||
Razor Blade | Bic | Chrome Platinum, used in slicing with vibratome | |
Scalpel Blade | Becton Dickinson (BD) | Number 24 | Used for slicing of tissue; recommended same size or smaller |
Superglue (Loctite Super Bonder) | Henkel | Composition: Etilcianoacrilato; 2-Propenoic acid; 6,6'-di-terc-butil-2,2'-metilenodi-p-cresol; homopolymer | |
Vibratome | Leica | 14047235612 – VT1000S | |
Name of Material/ Equipment for Immunohistochemistry | |||
Antibody anti-NeuN (mouse) | Millipore | MAB377 | Dilution 1:1,000 in Phosphate Buffer |
Antibody anti-GFAP (mouse) | Merck | MAB360 | Dilution 1:1,000 in Phosphate Buffer |
Antibody anti-Iba1 (rabbit) | Abcam | EPR16588 – ab178846 | Dilution 1:2,000 in Phosphate Buffer |
Biotinylated anti-mouse IgG Antibody (H+L) | Vector | BA-9200 | |
DAB | Sigma Aldrich | D-9015 | |
Entellan | Merck | 107960 | |
Ethanol | Merck | 1.00983.1000 | |
Gelatin | Synth | 00G1002.02.AE | Used for coating slides |
Microtome | Leica | SM2010R | Equipped with Freezing Stage (BFS-10MP, Physiotemp), set to -40ºC |
Normal Donkey Serum | Jackson Immuno Research | 017-000-121 | |
Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | 158127 | |
Rabbit IgG, HRP-linked whole Ab (anti-rabbit) | GE | NA934-1ML | |
Slides (Star Frost) | Knittel Glaser | Gelatin coated slides | |
Sucrose | Vetec | 60REAVET017050 | |
Vectastain ABC HRP Kit (Peroxidase, Standard) | Vector | PK-4000, Kit Standard | |
Xylene | Synth | 01X1001.01.BJ |