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Neuroscience

성인 인간의 뇌에서 단기 자유 부동 슬라이스 문화

Published: November 05, 2019
doi:
10.3791/59845
, , , , , , , , ,
1Department of Biochemistry and Immunology, Ribeirão Preto Medical School,University of São Paulo, 2Department of Physiology, Ribeirão Preto Medical School,University of São Paulo, 3Department of Pathology and Forensic Medicine, Ribeirão Preto Medical School,University of São Paulo, 4Department of Anatomy, Institute of Biosciences,São Paulo State University, 5Clinical Hospital at the Ribeirão Preto Medical School,University of São Paulo

Summary

성인 인간의 뇌에서 자유롭게 떠있는 슬라이스 문화를 준비하는 프로토콜이 제시된다. 상기 프로토콜은 멤브레인 인서트를 이용한 널리 사용되는 슬라이스 배양 방법의 변형이다. 그것은 간단 하 고, 비용 효율적인, 그리고 단기 측정 을 실행 하기 위한 권장 연령 관련 된 뇌 질환 뒤에 신경 변성의 메커니즘을 해명 하는 것을 목표로.

Abstract

Organotypic, 또는 슬라이스 문화, 널리 생체 외에서 작동 하는 중추 신 경계의 측면을 모델링 하기 위해 사용 되었습니다. 신경 과학에 슬라이스 문화의 잠재력에도 불구 하 고, 이러한 문화를 준비 하는 성인 신경 조직을 사용 하 여 연구는 여전히 부족, 특히 인간 과목에서 그. 슬라이스 배양을 준비하기 위해 성인 인간 조직의 사용은 설치류에서 생산 된 조각 (일반적으로 신생아)에서 생산 된 성숙한 인간의 뇌의 전형적인 독특한 특성을 보유하기 때문에 인간의 신경 병리학에 대한 이해를 향상시키는 데 특히 매력적입니다. 신경 조직. 이 프로토콜은 단기, 자유 부동 슬라이스 문화를 준비하기 위해 절제 뇌 수술에 제출 살아있는 인간 기증자에서 수집 된 뇌 조직을 사용하는 방법을 설명합니다. 이러한 배양을 사용하여 생화학및 세포 생물학 분석을 유지하고 수행하는 절차도 제시된다. 대표적인 결과는 전형적인 인간 피질 적층이 시험관내(DIV4)에서 4일 후에 슬라이스로 보존되고, 주요 신경 세포 유형의 예상 존재와 함께 입증된다. 더욱이, DIV4의 슬라이스는 독성자극(H2O2)에도전할 때 강력한 세포 사멸을 겪으며, 이는 세포 사멸 법제에서 플랫폼역할을 하는 이 모델의 잠재력을 나타낸다. 이 방법은, 막 삽입을 사용하여 널리 사용되는 프로토콜에 대한 간단하고 비용 효율적인 대안, 주로 연령과 관련된 뇌 질환 뒤에 신경 변성의 메커니즘을 해명하기위한 단기 분석법을 실행하는 것이 좋습니다. 마지막으로, 프로토콜은 약리성 측두엽 간질의 외과 적 치료에 제출 된 환자에서 수집 된 피질 조직을 사용하는 데 전념하지만, 다른 뇌 영역 / 조건에서 수집 된 조직도해야한다고 주장한다. 유사한 자유 부동 슬라이스 문화원을 생성하는 소스로 간주됩니다.

Introduction

연구에서 인간 샘플의 사용은 명백하게 인간의 뇌 병리학을 연구할 수있는 좋은 옵션이며, 현대 기술은 환자 유래 조직을 사용하여 강력하고 윤리적 인 실험을위한 새로운 방법을 열었습니다. 성인 인간의 뇌에서 준비 된 organotypic / 슬라이스 문화와 같은 방법은 광유전학1,전기 생리학2,3,4,5,가소성과 같은 패러다임에서 점점 더 많이 사용되고 있습니다. 6,7,8,9,신경 독성 / 신경 보호10,11,12,13,세포 치료14, 약물 스크리닝15,16,17,유전학 및 유전자 편집12,18,19,20,다른 사람의 사이에서, 더 나은 전략으로 성인기 동안 신경 질환을 이해.

인간의 뇌 병리의 근본적인 메커니즘의 이해는 많은 수의 과목을 필요로하는 실험 전략에 달려 있습니다. 반대로, 슬라이스 배양의 경우, 인간 샘플에 대한 접근은 여전히 어렵지만 단일 피질 샘플에서 최대 50 개의 조각을 생성 할 가능성은 부분적으로 증가하여 여러 자원 봉사자를 모집하는 요구 사항을 우회합니다. 수집된 조직당 복제 및 수행된비수치(21).

뇌 organotypic / 슬라이스 문화에 대한 몇 가지 프로토콜은 고전 oculo 초안22,23에서 롤러 튜브24, 25,26,반 투과성 멤브레인에 이르기까지 설명되었습니다. 인터페이스27,28,29,30, 자유 부동 슬라이스31,32. 실험 설계의 특수성에 따라 각 기술에는 고유한 장점과 단점이 있습니다. 성인 인간의 뇌에서 단기, 자유 부동 슬라이스 배양은 경우에 따라 Stoppini 등27에의해 사용되는 방법에 비해 유리하다, 사실 고려하면 시험관내에서 장기 세포 생존은 일반적으로 평가 할 때 주요 관심사입니다 배양 방법은, 많은 실험에서 배양에서 짧은 기간만 이들에게12,31,32,33,34,35가필요하다. 이러한 조건하에서, 자유 부동 배양의 사용은 2-3 주 동안 배양에 보관 된 조각보다 원래의 인간 조직 상태를 보다 정확하게 닮은 더 간단하고 비용 효율적인 장점을 제시한다.

신경 과학에 슬라이스 문화의 잠재력에도 불구 하 고, 이러한 문화를 준비 하는 성인 신경 조직을 사용 하 여 연구는 여전히 부족, 특히 인간의 과목에서. 이 문서는 자유 부동 슬라이스 문화를 준비하기 위해 절제 뇌 수술에 제출 살아있는 인간 기증자에서 수집 된 뇌 조직을 사용하는 프로토콜을 설명합니다. 이러한 배양을 사용하여 생화학 및 세포 생물학 분석을 유지하고 수행하는 절차는 상세히 설명되어 있다. 이 프로토콜은 성인기에 연결된 신경 병리학의 메커니즘에 대한 조사에서 생존력과 신경 기능을 분석하는 데 유용하다는 것이 입증되었습니다.

Protocol

살아있는 성인 뇌 조직은 약전성 측두엽 간질치료를 위한 용단신경외과를 받은 환자로부터 수득하였다(도1A). 모든 절차는 리베이라오 프레토 의과 대학 (17578/2015)의 클리닉 병원에서 윤리위원회의 승인을 받았으며 환자 (또는 법적 책임자)는 정보에 입각한 동의 조건에 동의하고 서명했습니다. 조직의 수집은 간질 외과 센터에서 신경 외과 팀에 의해 수행되었?…

Representative Results

배양된 슬라이스의 품질 및 건강을 평가하는 중요한 양상은 예상되는 신경 세포 유형, 뉴런 및 신경교 세포의 존재 및 전형적인 형태이다. 인간 피질 적층의 전형적인 구조는 DIV4에서 슬라이스에서 관찰되었고, 뉴런 면역 표지에 의해밝혀졌다(도 2D). 또한, 마이크로글리아 및 아스트로글리아의 예상존재(도 2B,C)도관찰되었다. ?…

Discussion

자유 부동, 단기 슬라이스 배양을 생산하기위한이 프로토콜은 성인 인간 신피질 조각을 배양하기위한 대체 방법입니다. 슬라이스 배양에 대한 이러한 프로토콜은 광유전학1,44,45,전기 생리학2,3,4,5에 대한 연구에 적합할 수 있습니다. <…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

이 작품은 FAPESP에 의해 지원된다 (그랜트 25681-3/2017 에 AS), CAPES (박사 후 펠로우십 PNPD / INCT-HSM A.F.와 N.D.M.에 박사 전 펠로우십) 및 FAEPA. G.M.A.는 FAPESP (MS 2018/06614-4)에서 석사 펠로우십을 보유하고 있습니다. N.G.C.는 CNPq 연구 펠로우십을 보유하고 있습니다. 우리는 이 연구 결과에 대한 절제된 조직을 기증해 준 환자와 그들의 가족에게 감사드립니다. 우리는 리베이라오 프레토 의과 대학, 상파울루 대학의 임상 병원에서 주민, 간호사, 기술자 및 CIREP 팀의 지원을 인정하고 싶습니다.

Materials

2-Propanol Merck 1096341000
Acrylamide/Bis-Acrylamide, 30% solution Sigma Aldrich A3449 
Agarose Sigma Aldrich A9539
Ammonium persulfate Sigma A3678-25G
Amphotericin B Gibco 15290-018
Antibody anti-ERK 2 (rabbit) Santa Cruz Biotecnology sc-154 Dilution 1:1,000 in BSA 2.5%
Antibody anti-pERK (mouse) Santa Cruz Biotecnology sc-7383 Dilution 1:1,000 in BSA 2.5%
B27 Gibco 17504-044
BDNF Sigma Aldrich SRP3014
Bovine Serum Albumin Sigma Aldrich A7906
Bradford 1x Dye Reagent BioRad 500-0205
EDTA Sigma T3924 Used in RIPA buffer
Glucose Merck 108337
Glutamax Gibco 35050-061
Hank's Balanced Salts Sigma Aldrich H1387-10X1L
Hepes Sigma Aldrich H4034
Hydrochloric acid Merck 1003171000
Hydrogen Peroxide (H2O2) Vetec 194
Mouse IgG, HRP-linked whole Ab (anti-mouse) GE NA931-1ML
NaCl Merck 1064041000 Used in RIPA buffer
Neurobasal A Gibco 10888-022
Non-fat dry milk (Molico) Nestlé Used for membrane blocking
PBS Buffer pH 7,2 Laborclin 590338
Penicilin/Streptomicin Sigma Aldrich P4333
Potassium Chloride Merck 1049361000
Prime Western Blotting Detection Reagent GE RPN2232
Rabbit IgG, HRP-linked whole Ab (anti-rabbit) GE NA934-1ML
SDS Sigma L5750 Used in RIPA buffer
TEMED GE 17-1312-01
Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide (MTT) Sigma Aldrich M5655
Tris Sigma T-1378 Used in RIPA buffer
Triton x-100 Sigma X100 Used in RIPA buffer
Ultrapure Water Millipore Sterile water, derived from MiliQ water purification system
Equipment and Material
24-well plates Corning CL S3526 Flat Bottom with Lid
Amersham Potran Premium (nitrocellulose membrane)  GE 29047575
Carbogen Mixture White Martins 95% O2, 5% CO2
CO2 incubator New Brunswick Scientific CO-24 Incubation of slices 5% CO2, 36ºC
Microplate Reader Molecular Devices
Microtubes Greiner 001608 1,5mL microtube
Motorized pestle Kimble Chase
Plastic spoon Size of a dessert spoon
Razor Blade Bic Chrome Platinum, used in slicing with vibratome
Scalpel Blade Becton Dickinson (BD) Number 24 Used for slicing of tissue; recommended same size or smaller
Superglue (Loctite Super Bonder) Henkel Composition: Etilcianoacrilato; 2-Propenoic acid; 6,6'-di-terc-butil-2,2'-metilenodi-p-cresol; homopolymer
Vibratome  Leica 14047235612 – VT1000S
Name of Material/ Equipment for Immunohistochemistry
Antibody anti-NeuN (mouse) Millipore  MAB377 Dilution 1:1,000 in Phosphate Buffer
Antibody anti-GFAP (mouse) Merck MAB360 Dilution 1:1,000 in Phosphate Buffer
Antibody anti-Iba1 (rabbit) Abcam EPR16588 – ab178846 Dilution 1:2,000 in Phosphate Buffer
Biotinylated anti-mouse IgG Antibody (H+L) Vector BA-9200
DAB Sigma Aldrich D-9015
Entellan Merck 107960
Ethanol Merck 1.00983.1000
Gelatin Synth 00G1002.02.AE Used for coating slides
Microtome Leica SM2010R Equipped with Freezing Stage (BFS-10MP, Physiotemp), set to -40ºC
Normal Donkey Serum Jackson Immuno Research 017-000-121
Paraformaldehyde Sigma Aldrich 158127
Rabbit IgG, HRP-linked whole Ab (anti-rabbit) GE NA934-1ML
Slides (Star Frost) Knittel Glaser Gelatin coated slides
Sucrose Vetec 60REAVET017050
Vectastain ABC HRP Kit (Peroxidase, Standard) Vector PK-4000, Kit Standard
Xylene Synth 01X1001.01.BJ
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Fernandes, A., Mendes, N. D., Almeida, G. M., Nogueira, G. O., Machado, C. d. M., Horta-Junior, J. d. A. d. C., Assirati Junior, J. A., Garcia-Cairasco, N., Neder, L., Sebollela, A. Short-Term Free-Floating Slice Cultures from the Adult Human Brain. J. Vis. Exp. (153), e59845, doi:10.3791/59845 (2019).
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