Intravital beeldvorming van epitheliale lymfocyten in muizen dunne darm

Summary

We beschrijven een methode om GFP-gelabeld γδ IELs met behulp van intravital Imaging van muizen dunne darm te visualiseren door omgekeerde spinnen schijf confocale microscopie. Deze techniek maakt het bijhouden van levende cellen in het slijmvlies voor maximaal 4 uur en kan worden gebruikt om een verscheidenheid van intestinale immuun-epitheel interacties te onderzoeken.

Abstract

Epitheliale lymfocyten uiten γδ T Cell receptor (γδ IEL) spelen een belangrijke rol in het immuunsysteem surveillance van het intestinale epitheel. Deels door het ontbreken van een definitief ligand voor de γδ T-cel receptor, blijft ons begrip van de regulatie van γδ IEL activering en hun functie in vivo beperkt. Dit vereist de ontwikkeling van alternatieve strategieën te ondervragen signalering trajecten die betrokken zijn bij de regulering van γδ IEL functie en de responsiviteit van deze cellen aan de lokale microenvironment. Hoewel γδ IELs op grote schaal worden begrepen om pathogeen translocatie te beperken, het gebruik van intravital Imaging is van cruciaal belang voor het begrijpen van de spatiotemporal dynamiek van IEL/epitheel interacties op Steady-State en in reactie op invasieve pathogenen. Hierin presenteren we een protocol voor het visualiseren van IEL trekgedrag in de kleine intestinale mucosa van een GFP γδ T Cell reporter muis met omgekeerde spinnen schijf confocale laser microscopie. Hoewel de maximale Imaging diepte van deze aanpak is beperkt ten opzichte van het gebruik van twee-foton laser-scanning microscopie, spinnen schijf confocale laser microscopie biedt het voordeel van hoge snelheid Beeldacquisitie met verminderde foto bleken en photodamage. Met behulp van 4D beeldanalyse software, T Cell surveillance gedrag en hun interacties met naburige cellen kunnen worden geanalyseerd na experimentele manipulatie om extra inzicht te geven in IEL activering en functie binnen de intestinale mucosa.

Introduction

Epitheliale lymfocyten (IEL) bevinden zich binnen het intestinale epitheel, en worden gevonden zowel langs de kelder membraan en tussen aangrenzende epitheelcellen in de laterale intercellulaire ruimte¹. Er is ongeveer één IEL voor elke 5-10 epitheelcellen; Deze IELs dienen als Sentinels om immuun toezicht van de grote uitgestrektheid van de intestinale epitheel barrière²te bieden. IELs het uitdrukken van de γδ T Cell receptor (TCR) bestaat uit tot 60% van de totale IEL populatie in de muizen dunne darm. Studies in γδ T-cel-gebrekkige muizen tonen een grotendeels beschermende rol van deze cellen in reactie op intestinale verwonding, ontsteking en besmetting^3,4,5. Ondanks de generatie van de Tcrd knock-out muis⁶, ons begrip van γδ iel biologie blijft beperkt te wijten aan het feit dat liganden erkend door de γδ TCR nog moeten worden geïdentificeerd⁷. Dientengevolge, heeft het gebrek aan hulpmiddelen om deze cel bevolking te bestuderen het moeilijk gemaakt om de rol van γδ TCR activering en functie onder fysiologische en pathologische voorwaarden te onderzoeken. Om dit gat te vullen, hebben wij levende beeldvormingstechnieken ontwikkeld om γδ IEL migrerend gedrag en interactie met naburige enterocyten als middel te visualiseren om extra inzicht in γδ IEL functie en ontvankelijkheid aan externe stimuli in vivo te verstrekken.

In de afgelopen tien jaar heeft intravital Imaging aanzienlijk uitgebreid ons begrip van de moleculaire gebeurtenissen die betrokken zijn bij meerdere facetten van intestinale biologie, met inbegrip van epitheelcellen afstoten⁸, regulering van de epitheel barrièrefunctie^{9 ,10}, myeloïde Cell bemonstering van Luminale inhoud¹¹,¹², en gastheer-microbe interacties^{11,13,14,15,16} . In het kader van de iel biologie heeft het gebruik van intravital microscopie licht geworpen op de spatiotemporal dynamiek van iel beweeglijkheid en de factoren die hun surveillance gedrag bemiddelen^{13,14,15, 16}. De ontwikkeling van TcrdH2BeGFP (TcrdEGFP) reporter muizen, die labels γδ IELs door nucleaire GFP expressie¹⁷, bleek dat γδ IELs zijn zeer beweeglijke binnen het epitheel en vertonen een unieke surveillance gedrag dat reageert op microbiële besmetting^17,13,14. Onlangs, werd een andere γδ T Cell reporter muis ontwikkeld (Tcrd-gdl) die GFP in het cytoplasma uitdrukt om visualisatie van volledige cel¹⁸toe te staan. Gelijkaardige methodologie is gebruikt om de eis van specifieke chemokinen receptoren, zoals G eiwit-gekoppelde receptor (GPCR)-18 en-55, op de dynamica van iel beweeglijkheid^19,20te onderzoeken. Bij afwezigheid van een cel-specifieke verslaggever, fluorescerende geconjugeerde antilichamen tegen CD8α werden gebruikt om te visualiseren en te volgen iel beweeglijkheid in vivo^19,20. Hoewel twee-foton laser scanning microscopie wordt vaak gebruikt voor intravital Imaging, het gebruik van spinnen schijf confocale laser microscopie biedt unieke voordelen voor hoge snelheid en High-Resolution Multi-Channel beelden vast te leggen met een minimale achtergrondruis. Deze technologie is ideaal om de spatiotemporal dynamiek van immuun/epitheel interacties in het complexe micromilieu van het intestinale slijmvlies te verhelderen. Bovendien, door het gebruik van verschillende transgene en/of knock-out muismodellen, deze studies kunnen inzicht geven in de moleculaire regulatie van intestinale immuun-en/of epitheelcellen functie.

Protocol

Alle studies werden uitgevoerd in een vereniging van de beoordeling en accreditatie van laboratorium Animal Care (AALAC)-geaccrediteerd faciliteit volgens protocollen goedgekeurd door de Rutgers New Jersey Medical School vergelijkende geneeskunde middelen. 1. muis voorbereiding Opmerking: De volgende procedure, met inbegrip van dierlijke voorbereiding en chirurgie, duurt 30 tot 40 min. voorafgaand aan de operatie, zet de Microscoop en warming-up van d…

Representative Results

Met behulp van intravital Imaging van TcrdEGFP reporter muizen, hebben we eerder aangetoond dat γδ IELs vertonen een dynamisch surveillance gedrag, waarin zij patrouilleren het epitheel door te migreren langs de kelder membraan en in de laterale intercellulaire ruimte (LIS) op steady staat (Figuur 2, film 1). Deze benadering kan ook worden gebruikt om te evalueren hoe de remming van specifieke cel signalering paden en/of receptoren invloeden γ?…

Discussion

De ontwikkeling van intravital microscopie technieken heeft een ongekende kans om de reorganisatie van subcellulaire structurenacht^,9,22, cel-cel interacties^{12, 25} en het migrerende gedrag van de cel¹³,^{14,15,16,26<…}

Materials

35mm dish, No. 1.5 Coverslip	MatTek	P35G-1.5-14-C
Alexa Fluor 633 Hydrazide	Invitrogen	A30634
BD PrecisionGlide Hypodermic needles – 27g	Thermo Fisher Scientific	14-826-48
BD Slip Tip Sterile Syringe – 1 ml	Thermo Fisher Scientific	14-823-434
BD Tuberculin Syringe	Thermo Fisher Scientific	14-829-9
Dissecting scissors	Thermo Fisher Scientific	08-940
Electrocautery	Thermo Fisher Scientific	50822501
Enclosed incubation chamber	OKOLAB		Microscope
Eye Needles, Size #3; 1/2 Circle, Taper Point, 12 mm Chord Length	Roboz	RS-7983-3
Hank's Balanced Salt Solution	Sigma-Aldrich	55037C
Hoechst 33342	Invitrogen	H3570
Imaris (v. 9.2.1) with Start, Track, XT modules	Bitplane		Software
Inverted DMi8	Leica		Microscope
IQ3 (v. 3.6.3)	Andor		Software
Ketamine	Putney		Anesthesia
Kimwipes	VWR	21905-026
McPherson-Vannas scissors 3” (7.5 cm) Long 5X0.15mm Straight Sharp	Roboz	RS-5600
Non-absorbable surgical suture, Silk Spool, Black Braided	Fisher Scientific	NC0798934
Nugent Forceps 4.25” (11 cm) Long Angled Smooth 1.2mm Tip	Roboz	RS-5228
Puralube Vet Ointment	Dechra		Lubricating Eye Ointment
Spinning disk Yokogawa CSU-W1 with a 63x 1.3 N.A. HC PLAN APO glycerol immersion objective, iXon Life 888 EMCCD camera, 405 nm diode laser, 488 nm DPSS laser, 640 nm diode laser	Andor		Confocal system
Xylazine	Akorn		Anesthesia