종양 대식 세포 상호 작용을 연구 하는 시험관 내 분석
Summary
본 문서는 대식세포를 유치하기 위해 종양 세포로부터 조절된 배지의 능력을 평가하는 유용한 시험관내 분석방법을 나타낸다.
Abstract
종양 관련 대식세포 (TAM)는 암의 다른 모형을 위한 종양 질량에 있는 세포의 큰 비율을 차지합니다. 아교 모세포종 (GBM), 치료법이없는 악성 뇌종양은 종양 질량 의 절반까지 있습니다. TAM은 세포에서 특정 유전자의 활성화에 따라 종양 또는 항종양일 수 있다. 종양에 있는 유전 돌연변이는, 핑거레이토카인 발현을 통제해서, 종양 미세 환경에 TAM의 모집에 영향을 미칠 수 있습니다. 여기서, 우리는 종양 세포로부터의 조절된 배지에 의한 대식세포 모집을 평가하기 위한 정량적 세포 기반 분석방법을 기술한다. 이 분석은 인간 대식세포주 MV-4-11을 사용하여 교모세포종으로부터 조절된 배지에 의한 대식세포 인매력을 연구하여 높은 재현성과 낮은 가변성을 허용합니다. 이 분석으로 생성된 데이터는 종양과 종양 미세 환경 사이의 상호 작용에 대한 더 나은 이해에 기여할 수 있다. 유사한 분석은 종양 세포와 T 세포 및 자연 살인자 (NK) 세포를 포함하여 그밖 면역 세포 사이 상호 작용을 평가하기 위하여 이용될 수 있습니다.
Introduction
대식세포는 높은 자형질 및 기능적 이질성을가진 면역 세포1. 그들은 숙주 방어 시스템, 조직 수리, 발달및 종양 진행에 중요한 역할을 한다 1. TAM은 고형 종양의 미세 환경의 대식세포입니다. 특정 T는 T 세포 매개 세포 독성 활성을 억제하고, 종양 미세 환경(TME)을 조절하고, 혈관신생, 침입 및 전이 를 촉진하여 종양 성장을 촉진할 수있습니다2,3,4, 5.TAM은 TME에서 가장 풍부한 세포 유형 중 하나이며 더 많은 수의 TAM은 일반적으로 많은유형의 고형 종양에서 환자 생존과 상관 관계가 6. 종양 세포의 명백한 유전 서명은 대식세포를 모집하는 그들의 기능에 영향을 미칩니다. GBM에서, 아무 치료도 없는 공격적인 뇌종양, 대식세포는 종양질량 7의 반까지 나타낼 수 있습니다. 표피 성장 인자 수용체(EGFR)와그의 절단 돌연변이체 EGFRvIII의 공동 증폭은 종양 성장 이점을 부여하는 GBM에서 빈번히 관찰되며, 이는8. EGFR 및 EGFRvIII를 공동 발현하는 세포는 EGFR 또는 EGFRvIII를 발현하는 세포에 비해 더 많은 대식세포를 유치한다 7.
케모카인은 TME6,9에서면역 조성을 조절하는 데 중요한 역할을 하는 작은 사이토카인의 가족이다. 인간 세포는 50개 이상의 사이토카인10개이상을 발현한다. 종양에서의 면역 침윤은 주로 사이토카인과 사이토카인수용체(11)사이의 상호작용에 의해 실현된다. 면역 세포의 각 유형은 뚜렷한 케모카인 수용체/케모카인을 발현하고 특정 케모카인/케모카인 수용체12를분비하는 세포에 의해 모집될 수 있다. 암세포는 TAM, 조절 T 세포 및 골수성 유래 억제세포(MDSCs)와 같은 면역 세포를 모집하기 위해 특정 케모카인의 발현을 증가시킬 수있다6. 종양에 의해 분비되는 특정 케모카인의 봉쇄는 종양 덩어리로 면역 세포의 침투를 억제하는 유망한 방법이 될 수 있다.
여기서, 우리는 화학피닌 및 대식세포 세포주를 포함하는 종양 세포로부터의 컨디셔닝된 매체를 사용하여 종양-대식세포 상호작용의 시험관내 평가를 허용하는 프로토콜을 기술한다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 프로토콜에는 1) Transwell 삽입물의 선택이라는 몇 가지 주요 단계가 있습니다. MV-4-11 세포주, 5 μm 트랜스웰 인서트가 잘 작동합니다. 그러나, 일반적으로 사용되는 단핵구 세포주 THP-1과 같은 다른 세포주, 다른 기공 크기는 더 잘 작동 할 수 있습니다. 2) 다른 세포주가 다른 속도로 증가함에 따라, 세포 수에 따라 조절 된 매체의 부피를 조정하는 것이 중요합니다. 이를 위해, 동일한 실험 조건 하…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
교부금 지원: Z. An은 알렉스의 레모네이드 스탠드 재단, 미국 뇌종양 협회, NIH T32CA108462 및 획기적인 생물 의학 연구 프로그램으로부터 지원을 받았으며, 이는 부분적으로 샌드러 재단에 의해 지원됩니다. W. 와이즈는 NIH 보조금 R01CA221969, R01NS091620, P50CA097257, U01CA217864, P30CA82103에 의해 지원되었다; 새뮤얼 G. 왁스만 암 연구 재단; 그리고 에블린과 매티 앤더슨 의자.
Materials
| 0.1 μm filtration cup | Thermo fisher | 566-0010 | |
| 0.45 μm filter unit | Millipore | SLHA033SS | |
| 10 mL serological pipettes | Olympus plastics | 12-104 | |
| 15mL sterile centrifuge tubes | Olympus plastics | 28-103 | |
| 1 mL pipette tip | ART molecular bioproducts | 2779-RI | |
| 2 mL aspirating pipet | Falcon | 357558 | |
| 24-well plate | Millipore | ECM507 | Part of ECM507, or can be purchased separately |
| 4x lysis buffer | Millipore | ECM507 | Part of ECM507, or can be purchased separately |
| 5 μm Transwell insert | Millipore | ECM507 | Part of ECM507, or can be purchased separately |
| 75cm2 flask | Corning | 430641U | |
| Accutase | Innovative cell technologies | AT-104 | |
| B27 | Gibco | 12587-010 | |
| CyQuant Dye | Millipore | ECM507 | Part of ECM507, or can be purchased separately |
| DMEM | Gibco | 11965-092 | |
| DMEM:F12 | Gibco | 10565-018 | |
| EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| FBS | Gibco | 26140 | |
| FGF | Peprotech | 100-18B | |
| IMDM | Gibco | 12440-053 | |
| PBS | Gibco | 14190-144 | |
| Pen Strep | Gibco | 15140-122 | |
| Trypan blue | Biorad | 1450021 |
References
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