Denne artikkelen representerer en nyttig in vitro-analysen for å evaluere evnen til betinget medium fra tumorceller å tiltrekke makrofager.
Tumor forbundet makrofager (TAMs) står for en stor prosentandel av cellene i tumor massen for ulike typer kreft. Glioblastom (GBM), en ondartet hjernesvulst uten kur, har opptil halvparten av tumor massen TAMs. TAMs kan være Pro-tumoral eller anti-tumoral, avhengig av aktivering av spesifikke gener i cellene. Genetiske mutasjoner i tumorer, gjennom regulering cytokin uttrykk, kan påvirke rekruttering av TAMs til tumor mikromiljøet. Her beskriver vi en kvantitativ celle-basert analyse for å vurdere macrophage rekruttering av betinget medium fra tumorceller. Denne analysen bruker den menneskelige macrophage cellelinje MV-4-11 for å studere macrophage attraksjon ved betinget medium fra glioblastom, noe som åpner for høy reproduserbarhet og lav variasjon. Data generert med denne analysen kan bidra til en bedre forståelse av samspillet mellom tumor og tumor mikromiljøet. Lignende analysen kan brukes til å vurdere samspillet mellom tumorceller og andre immunceller, inkludert T-celler og naturlig Killer (NK) celler.
Makrofager er immunceller med høy fenotypiske og funksjonell heterogenitet1. De spiller viktige roller i verts forsvaret systemer, reparasjon av vev, utvikling og tumorprogresjon1. TAMs er makrofager i mikromiljøet av solide svulster. Visse TAMs kan fremme tumor vekst gjennom hemme T Cell-mediert cytotoksisk aktivitet, modulerende svulsten mikromiljøet (TME), fremme angiogenese, invasjon og metastasering2,3,4, 5. TAMs er blant de mest tallrike celletyper i TME og høyere antall TAMs generelt samsvarer med verre pasient overlevelse i mange typer solide svulster6. De distinkte genetiske signaturene i tumorcellene påvirker deres evne til å rekruttere makrofager. I GBM, en aggressiv hjernesvulst uten kur, makrofager kan representere opptil halvparten av tumor massen7. Co-forsterkning av epidermal vekstfaktorreseptor (EGFR) og dens avkorting mutant EGFRvIII er ofte observert i GBM, som gir tumor vekst fordeler8. Celler co-uttrykker EGFR og EGFRvIII tiltrekke flere makrofager i forhold til celler som uttrykker EGFR eller EGFRvIII enkeltvis7.
Chemokiner er en familie av små cytokiner som spiller en betydelig rolle i å regulere immunforsvaret iTME. Menneskelige celler uttrykker mer enn 50 cytokiner10. Immun infiltrasjon i svulster er i stor grad realisert ved samspillet mellom cytokiner og cytokin reseptorer11. Hver type immunceller uttrykker distinkte chemokine reseptorer/chemokiner og kan bli rekruttert av celler sekresjon spesifikke chemokiner/chemokine reseptorer12. Kreftceller kan øke uttrykk for visse chemokiner å rekruttere immunceller som TAMs, regulatoriske T celler og myelogen Suppressor celler (MDSCs)6. Blokade av spesifikke chemokine skilles ut av svulster kan være en lovende måte i hemme infiltrasjon av immunceller i tumor massen.
Her beskriver vi en protokoll som tillater in vitro evaluering av tumor-macrophage interaksjon, ved hjelp av betinget Media fra tumorceller som inneholder chemokiner og macrophage cellelinjer.
I denne protokollen er det flere viktige trinn: 1) valg av Transwell innsats. For MV-4-11 cellelinje 5 μm Transwell setter fungerer godt. Men for andre cellelinjer som vanlig brukte monocytt cellelinje THP-1, kan en annen pore størrelse fungere bedre. 2) som forskjellige cellelinjer vokser i forskjellige hastigheter, er det viktig å justere volumet av de conditioned Media i henhold til celle tall. For dette formålet kan celle frie medier som er inkubert under de samme eksperimentelle forholdene, brukes til å fortynn…
The authors have nothing to disclose.
Grant Support: Z. en mottatt støtte fra Alex ‘ s lemonade stand Foundation, American Brain tumor Association, NIH T32CA108462 og program for gjennombrudd Biomedical Research, som er delvis finansiert av Sandler Foundation. W. Weiss ble støttet av NIH tilskudd R01CA221969, R01NS091620, P50CA097257, U01CA217864, P30CA82103; Samuel G. Waxman Cancer Research Foundation; og Evelyn og Mattie Anderson Chair.
0.1 μm filtration cup | Thermo fisher | 566-0010 | |
0.45 μm filter unit | Millipore | SLHA033SS | |
10 mL serological pipettes | Olympus plastics | 12-104 | |
15mL sterile centrifuge tubes | Olympus plastics | 28-103 | |
1 mL pipette tip | ART molecular bioproducts | 2779-RI | |
2 mL aspirating pipet | Falcon | 357558 | |
24-well plate | Millipore | ECM507 | Part of ECM507, or can be purchased separately |
4x lysis buffer | Millipore | ECM507 | Part of ECM507, or can be purchased separately |
5 μm Transwell insert | Millipore | ECM507 | Part of ECM507, or can be purchased separately |
75cm2 flask | Corning | 430641U | |
Accutase | Innovative cell technologies | AT-104 | |
B27 | Gibco | 12587-010 | |
CyQuant Dye | Millipore | ECM507 | Part of ECM507, or can be purchased separately |
DMEM | Gibco | 11965-092 | |
DMEM:F12 | Gibco | 10565-018 | |
EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
FBS | Gibco | 26140 | |
FGF | Peprotech | 100-18B | |
IMDM | Gibco | 12440-053 | |
PBS | Gibco | 14190-144 | |
Pen Strep | Gibco | 15140-122 | |
Trypan blue | Biorad | 1450021 |