효모 사카로미세세스 세레비시아에서새로 전사된 RNA를 민감하게 그리고 구체적으로 정화하기 위해 티오레이드 우라실을 사용한다.
뉴클레오티드 유사체, 4-티우라실 (4tU)은 세포에 의해 쉽게 채택되고생체 내에서 전사될 때 RNA에 통합되어 짧은 기간 동안 생산된 RNA를 분리할 수 있습니다. 이는 스트렙타비딘 코팅 비드를 사용하여 통합된 티오기와 친화도 정화에 비오틴 모이어티를 부착함으로써 수행된다. 기존 RNA가 없는 순수하고 새로 합성된 RNA의 좋은 수율을 달성하면 라벨링 시간이 단축되고 운동 연구에서 시간적 분해능이 증가합니다. 이것은 새로 합성된 RNA의 매우 특이하고 높은 수율 정제를 위한 프로토콜이다. 여기에 제시된 프로토콜은 효모 사카로마이세스 세레비시아에서 RNA가 어떻게 추출되는지 설명합니다. 그러나, 총 RNA로부터 티오레이트 RNA의 정제를 위한 프로토콜은 일단 세포로부터 추출되면 임의의 유기체로부터 RNA를 사용하여 효과적이어야 한다. 정제된 RNA는 역전사-qPCR, RNA-seq 및 SLAM-seq와 같은 많은 널리 사용되는 기술에 의한 분석에 적합하다. 이 기술의 특이성, 감도 및 유연성은 RNA 대사에 대한 비교할 수없는 통찰력을 허용합니다.
RNA는 역동적인 성질을 가지고 있다; 생산 직후 많은 RNA가 빠르게 처리되고 저하됩니다. 현재, RNA 물질 대사의 대부분의 연구는 총 세포 RNA를 분석, 이는 주로 완전히 처리 및 정상 상태 수준에서. 이 수준은 전사, 전사 후 성숙 및 저하 속도 사이의 균형에 따라 달라집니다. 안정된 상태 평형으로 이끌어 내는 프로세스의 분석은 아주 단명한 RNA 종을 붙잡기 위하여 전문화한 기술이 필요합니다.
4-티우라실 (4tU) 또는 4-티오리딘 (4sU)과 같은 뉴클레오티드 유사체를 가진 RNA의 대사 라벨링 (우수한 검토를 위해 더피 등1 참조), 티오 라벨 된 초기 RNAs 및 처리 중간체를 분리하는 기능을 제공합니다. 그러나, 게시된 프로토콜은 많은 전사체의 생산 속도에 비해 느린 몇 분2,3의라벨링 시간을 포함한다. 평균 효모 유전자를 전사하는 데 1 분의 순서로 걸리므로 효모 RNA를 1 분 미만으로 표시하는 것은 매우 짧은 것으로 간주 될 수 있습니다. 매우 신속하고 특정한 4티우라실 프로토콜(ers4tU)은 4tU 통합을 최대화하고 라벨이 부착되지 않은 기존 RNA의 회수를 최소화하여 신호대 잡음 비를 최대화하여 라벨링 시간을 매우 짧게 만드는 4.
티오-변형염기는 새로 합성된 RNA(nsRNA)에 효율적으로 라벨을 붙일 수 있도록 세포 내로 신속하고 충분한 양을 수입해야 한다. 이를 촉진하기 위해, 세포는 우라실 프리 배지에서 성장하고, 적절한 파마이즈의 발현은 4tU 또는 4sU 섭취량을 증진시키는 데 도움이 된다(적절한 파마이즈 유전자 및 보충체 도1을 운반하는 플라스미드의 리스트에 대한 표 1 참조). 4tU의 수산화 나트륨 용해도는 다른 뉴클레오티드 유사체가 요구하는 독성 유기 용매의 필요성을 방지합니다. 불행히도, 50 μM 이상의 농도에서 티오 변형 뉴클레오시드를 가진 장기간 성장하는 배양은 리보솜5를방해하는 것으로 관찰되었다. 그러나, 여기서 사용되는 농도(10 μM)는 매우 짧은 라벨링 시간, 해로운 효과를 최소화5(도1a),여전히 분석을 위한 충분한 RNA를 산출하면서.
이 기술은 표적 단백질6,7의 신속하고 특이적인 보조 매개 고갈과 결합될 수 있으며, “β-est AID 4U” 프로토콜로 지칭되며, 이 프로토콜은 β-estradiol 조절식이 있는 보조제의 유도성 다채기(AID) 시스템은 4tU 라벨링과 결합됩니다. β-est AID 4U 접근법을 사용하면 표적 단백질이 고갈될 수 있고 RNA대사에 미치는 영향이 면밀히 모니터링될 수 있다(그림 2). 타이밍은 매우 중요합니다. 함께 제공되는 비디오를 보고 그림 2와 애니메이션 된 양식에 주의를 기울이는 것이 좋습니다 (추가 그림 2참조).
정확한 시간 해결을 위해 RNA의 처리 및 분해를 매우 신속하게 중단해야 합니다. 이는 저온에서 메탄올을 사용하여 달성되며, 이는 세포 내용물들을 매우 빠르게 고정시키고 핵산함량을유지하면서 세포막을 저하시킵니다 8. RNA 추출은 효율적이어야 하며 RNA를 손상시키지 않아야 합니다. 기계적 인해는 chaotropic 에이전트의 부재에서 효과적입니다 (종종 이들은 티오 그룹을 포함하므로 피해야한다). RNA의 염화리튬 침전은 tRNA가 덜 효율적으로 침전되기 때문에 바람직하다. tRNA는 급속하게 전사되고 자연적으로thiolated 9, 그래서 제거 tRNAs는 생물 항성 시약에 대한 경쟁을 감소시킵니다. 작고 고도로 구조화 된 RNA가 관심이있는 경우 알코올 기반 RNA 침전 방법이 권장됩니다.
티오레이트 RNA를 회수하기 위해, 비오틴은 4tU를 가진 RNA내로 통합된 티오기를 통해 공유적으로 부착된다. 클레블 이황화물 결합을 통해 부착되는 변형 된 비오틴 (예를 들어, HPDP-biotin (N-[6-(Biotinamido)h엑실]-3 ́-(2́-p yridyldithio)propionamide, 또는 MTS-비오틴(메탄 티오불폰)을 사용하는 것이 좋습니다. 환원제를 첨가하여 RNA의 방출을 허용한다. 생체별화된 RNA는 자기 구슬에 결합된 스트렙타비딘상에서 화합성을 정제한다. 이 프로토콜은 이전에나열된 다른 프로토콜과 유사하지만 배경을 줄이기 위해 집중적으로 최적화되었습니다.
수행 될 수있는 티올 라벨링 실험의 두 가지 유형이 있습니다, 연속 및 불연속 라벨링. 각각은 자신의 장점이 있습니다. 연속 라벨링에서 4tU는 일정한 간격으로 채취한 배양 및 샘플에 첨가된다. 실험의 이 모형은 RNA가 처리되는 방법 및 수준이 시간이 지남에 따라 어떻게 변화하는지 보여줍니다. 예로는 야생형 실험및 펄스체이스 실험과 돌연변이의 비교가 있다. 도 3b,c에 도시된 실험은 이러한 유형이다. 불연속 라벨링의 경우 변경이 시스템 내로 유도되고 RNA가 모니터링됩니다. 변경이 유도되면 배양은 여러 하위 문화로 분할되어야하며 특정 시간에 각 문화는 짧은 기간 동안 티오 라벨로 표시됩니다. 일예는 도 27에도시된 β-est AID 4U이다. 이러한 유형의 실험은 RNA 처리에 대한 대사 변화의 효과를 모니터링하는 데 특히 유용합니다(도 3d참조).
티오 라벨링 실험의 그래픽 표현은 그림 4 및 그림5에 표시되며 프로토콜의 성능을 크게 단순화하는 스프레드시트를 사용할 수 있습니다(4tU 실험 template.xlsx참조). 이뿐만 아니라 추가 정보에는 광범위한 문제 해결 가이드가 포함되어 있습니다. 4tU 라벨링을 auxin 고갈 프로토콜과 통합하는 β-est AID 4U 프로토콜의 경우 그림 2 및 보충 그림2를 참조하십시오. 자세한 AID 고갈 프로토콜은 Barrass 외 7을 참조하십시오.
이 문서는 매우 신속하고 특정 4tU 라벨링에 대한 프로토콜을 제시, 초기의 회복을위한, 라벨링의 작은 후 S. cerevisiae에서 새로 합성 된 RNA 15 s, 라벨이 없는 RNA에 의해 매우 낮은 오염.
사용자는 항상 차가운 온도와 DEPC 처리 된 시약을 사용하여 RNA의 무결성을 유지하기 위해주의를 기울여야합니다. 스트렙타비딘 비드 정제는 일반적으로 신뢰할 수 있다; 그러나 비드 버퍼는 처리하기가 어렵습니다. 그것은 그것의 구성 요소가 올바른 순서로 추가, 신선하게 만들어야하며, 냉장 또는 오토 클레이브하지. 일반적인 실패는 침전 단계 후에 불완전하게 용해되는 RNA를 포함하고, 그래서 처리 단계 도중 biotinylated 또는 그렇지 않으면 분실되지 않는. 보충 자료에는 광범위한 문제 해결 도움말이 있습니다.
ers4tU에서 알아야 할 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 이미 언급 한 것은 4tU효모의 성장이느려졌다는 것입니다(도 1a). 내인성 RNA 9를 제외하고,라벨링 기간 동안 전사 된 RNA 만이이 방법으로 정제 될 수 있습니다. 티올화 시간 내내 유전자에 일시 중지된 폴리머라제는 정제될 수 있는 티오화된 전사체를 생성하지 않지만, 티올화 동안 일시 중지된 상태로 들어가거나 떠나는 중합체로 인해 부분적으로 표지된 전사체는 회수될 수 있다. 돌연변이 또는 성장 조건 때문에 제대로 전사하는 균주는 다른 방법에 비해 nsRNA의 회복을 향상시킬 수 있지만 여기에 사용되는 기술은 거의 nsRNA를 생성하지 않습니다. 이러한 균주 및 조건에서 더 긴 시간 및 증가 된 배양 볼륨이 필요할 수 있습니다. 우라실은 질소의 좋은 소스이며, 그래서이 방법은 질소 기아와 관련된 연구에 사용되기 전에 시험되어야한다.
ers4tU 프로토콜은 수명이 짧은 RNA의 분석에 특히 유용하며, 그 중 상당수는 급격히 저하되어 분해 기계를 손상시키지 않고는 식별할 수 없습니다. 예로는 비밀불안정성 전사체(CUTs)4, 프로모터(PROMPTs) 19로부터의 조기 종단 또는 프로모터 근위정 일시중지 및안티센스 전사 “업스트림”에 의해 생성된 짧은 전사체를 포함한다. 안정한 RNA 종의 처리 도중 생성된 중간체는 또한 일시적이지만 ers4tU전사 4를 사용하여 풍부하게 될 수 있다. ers4tU 프로토콜은 그러므로 다른 방법에 비해 큰 이점인 가까운 생리적 조건 하에서 분석되고 포획되는 높게 과도한 RNA 종을 허용하는 예외적입니다. 이 기술은 정상20보다더 빨리 또는 느리게 길게 하는 RNA 폴리머라제 돌연변이체에서 전사 및 하류 RNA 처리 역학을 연구하는 데 사용되어 왔다.
Thiolation은 또한 RNA-seq 및 SLAM-seq21과호환되므로 매우 짧은 시간 내에 생성된 모든 RNA가 정교한 디테일을 특징으로 합니다.
The authors have nothing to disclose.
이 작품은 JB [104648]에 웰컴 자금 에 의해 지원되었다. 세포 생물학을 위한 웰컴 센터에서 일은 Wellcome 코어 자금 조달 [092076]에 의해 지원됩니다. 저자들은 벨라 모들린, 에마누엘라 사니, 수잔나 드 루카스-아리아스, 샤이니 조지 등 연구실 구성원들의 도움을 인정한다. 저자는 또한 플라스미드 YEpEBI31111에대한 패트릭 크레이머에게 감사하고 싶습니다 .
β-mercaptoethanol (βME) | Sigma-Aldrich | M3148 | CAUTION toxic. Stock solutions are aproximatly 14 M, make at 1/20 dilution for use |
Chloroform | Sigma-Aldrich | 25668 | CAUTION toxic |
Diethyl pyrocarbonate (DEPC) | Sigma-Aldrich | D5758 | add 1/1000 volume to a solution, leave at room temperature for 24 h, then autoclave |
DMF (N,N-dimethylformamide) | Sigma-Aldrich | 227056 | CAUTION toxic |
EDTA | Sigma-Aldrich | 3609 | Make 0.5 M and pH to 8.0 with sodium hydroxide |
Ethanol | Sigma-Aldrich | 29221 | |
EZ-link HPDP Biotin | Thermo scientific | 21341 | Store protected from light. Disolve all the vial contents in 22.7 mL DMF (to make a 4 mM stock solution). Store away from water, in the dark & at -20 °C. Check the solution before using, as some batches of HPDP precipitate in storage; heat at 42 °C to resuspend. |
Glucose | Fisher Scientific | G/0500/60 | |
Glycogen [20 mg/mL] | Sigma-Aldrich | 10901393001 | Store at -20 °C |
Immobilised TCEP Disulfide Reducing Gel | Thermo Scientific | 77712 | Optional |
LiCl | Sigma-Aldrich | 793620 | 10 M solution. CAUTION: this gets very hot as is dissolves and can even boil at greater than 100 oC, add the LiCl crystals to the water slowly. |
Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | 63033 | 1 M solution. CAUTION: this gets very hot as is dissolves and can even boil at greater than 100 oC, add the MgCl2 crystals to the water slowly. |
Methanol | Fisher Scientific | M/4000/PC17 | CAUTION Toxic and flammable |
NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S3139 | Make 1 M solutions of each and mix in equal amount to obtain a solution of the appropriate pH |
Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S3264 | |
NaCl | Sigma-Aldrich | S9888-M | 5 M solution |
Phenol, low pH. | Sigma-Aldrich | P4682 | Store in the dark at 4 °C. CAUTION toxic |
Phenol Chloroform 5:1 (125:24:1) low pH. | Sigma-Aldrich | P1944 | Store in the dark at 4 °C. CAUTION toxic |
Pierce Spin Columns | Thermo Scientific | 69702 | Optional |
SCSM single drop-out –ura | Formedium | DSCS101 | |
Sodium Acetate | Sigma-Aldrich | 32318-M | Make a 3 M solution and pH to 5.3 with acetic acid |
Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 795429 | CAUTION corrosive |
SDS (Sodium dodecyl sulfate) | Sigma-Aldrich | 436143 | CAUTION irritant, do not inhale |
Streptavidin Magnetic beads | NEB | 1420S | Store at 4°C |
SUPERase-In, RNase inhibitor | Life technologies | AM2696 | Store at -20°C |
Thiolated Schizosaccharomyces pombe for spike | See section 1.7 of the protocol | ||
4-thiouracil (4tU) | ACROS ORGANICS | 359930010 | Store in the dark. Make 100 mM Stock in 1M NaOH, store solutions at -20°C. |
Tris base | Sigma-Aldrich | 93362 | 1 M solutions at various pH |
tRNA | Sigma-Aldrich | 10109541001 | 5mg/ml, store at -20°C |
Uridine | Sigma-Aldrich | U3750 | Make 1 M solution in H2O. Split into 2 mL aliquots and store at -20 C. |
Yeast nitrogen base without amino acids with amonium sulphate | Formedium | CYN0410 | |
Zeba Columns 0.5ml | Thermo Scientific | 89882 | Store at 4 °C |
Zirconia beads | Thistle Scientific | 110791052 | |
Equipment and Consumables | |||
Beadbeater | Biospec | 112011EUR | Other homogenisers can be used; the correct conditions for each homogeniser and strain must be established. |
Bioanalyser (Agilent) or similar to assess RNA quality. If this is not important a spectrophotometer is useful to quantify the RNA. | |||
Centrifuge: capable of spinning cultures at 4 °C and at least 3000 g. Pre-chill if possible. | |||
Centrifuge: capable of spinning up to 2 mL tubes at variable speeds upto 13,000 g and down to 1000 g | |||
Magnetic rack for separating the beads from the sample. The one used in the paper is 3D printed, available from Thingiverse (thing:3562952). Comercially available racks exist | |||
PCR machine with a heated lid that will allow incubation in the dark. | |||
Rotating wheel to rotate 1.5 mL tubes end over end | |||
Shaking heating block (such as Eppendorf Thermomixer) is recomended | |||
Tubes, centrifuge, Low retention, RNase free 0.5mL | Eppendorf | H179467N | |
Tubes, centrifuge, Low retention, RNase free 1.5mL | Ambion | AM12350 | |
Tubes, centrifuge, 50 mL | Sarstedt | 62.547.004 | Other centrifuge tubes are not gas proof allowing CO2 to disolve in the methanol, this comes out of solution vigorously on adding warm culture, leading to sample loss |
Tubes, centrifuge, 15 mL | Sarstedt | 62.554.001 | |
Tubes, 2 mL, screw cap | Greiner | 723361 | |
Tubes 0.2 mL strip of 8 with integral lids | Brand | 781332 |