Специфический цикл клеток Измерение З2АКС и Апоптоза после генотоксического стресса с помощью цитометрии потока
Summary
Представленный метод сочетает в себе количественный анализ двухструйных разрывов ДНК (DSB), распределения клеточного цикла и апоптоза, позволяющих проводить оценку индукции и ремонта клеточного цикла DSB, а также последствия отказа от ремонта.
Abstract
Представленный метод или слегка измененные версии были разработаны для изучения конкретных ответов на лечение и побочных эффектов различных противораковых методов лечения, используемых в клинической онкологии. Это позволяет количественно и продольный анализ ответ повреждения ДНК после генотоксического стресса, как индуцированные лучевой терапии и множество противораковых препаратов. Метод охватывает все этапы реакции повреждения ДНК, обеспечивая конечные точки для индукции и ремонта двухструйных разрывов ДНК (DSBs), ареста клеточного цикла и смерти клеток апоптозом в случае отказа ремонта. Объединение этих измерений предоставляет информацию о клеточном цикле зависимых последствий лечения и, таким образом, позволяет углубленное изучение взаимодействия между клеточной пролиферации и борьбы механизмов против повреждения ДНК. Поскольку эффект многих терапевтических средств рака, включая химиотерапевтические агенты и ионизирующее излучение, ограничен или сильно варьируется в зависимости от конкретных фаз клеточного цикла, коррелятивные анализы опираются на надежный и осуществимый метод оценки последствий лечения ДНК в клеточном цикле-специфическим образом. Это невозможно с помощью анализов с одной точкой и важным преимуществом представленного метода. Метод не ограничивается какой-либо конкретной клеточной линии и был тщательно протестирован во множестве опухолей и нормальных линий клеток ткани. Он может быть широко применен в качестве всеобъемлющего исследования генотоксичности во многих областях онкологии, кроме радиоонкологии, включая оценку фактора риска окружающей среды, скрининг аттестата и оценку генетической нестабильности в опухолевых клетках.
Introduction
Целью онкологии является убийство или инактивация раковых клеток без ущерба для нормальных клеток. Многие методы лечения прямо или косвенно вызывают генотоксический стресс в раковых клетках, но и некоторые распространяются в нормальных клетках. Химиотерапия или целевые препараты часто сочетаются с лучевой терапиейдля повышения радиочувствительности облученной опухоли 1,2,3,5,что позволяет снизить дозы облучения, чтобы свести к минимуму нормальное повреждение тканей.
Ионизирующее излучение и другие генотоксические агенты вызывают различные виды повреждений ДНК, включая базовые модификации, поперечные ссылки нити и разрывы с одной или двойной нитью. Разрывы ДНК двойной нити (DSBs) являются наиболее серьезными поражениями ДНК и их индукции является ключом к клеточной смерти эффект ионизирующего излучения и различных цитостатических препаратов в радиохимиотерапии. DSB не только вредят целостности генома, нои способствуют образованию мутаций 6,7. Таким образом, различные пути ремонта DSB, и механизмы для устранения непоправимо поврежденных клеток, как апоптоз разработали в ходе эволюции. Вся реакция повреждения дна (DDR) регулируется сложной сетью сигнальных путей, которые достигают от распознавания повреждений ДНК и ареста клеточного цикла, чтобы позволить для ремонта ДНК, запрограммированной смерти клетки или инактивации в случае отказа ремонта8.
Представленный цитометрический метод потока был разработан для исследования DDR после генотоксического стресса в одном комплексном исследовании, который охватывает индукцию и ремонт DSB, а также последствия отказа ремонта. Он сочетает в себе измерение широко применяемого маркера DSB ЗH2AX с анализом клеточного цикла и индукцией апоптоза, используя классический анализ subG1 и более конкретную оценку активации caspase-3.
Сочетание этих конечных точек в одном анализе не только уменьшает время, затраты на рабочую силу и затраты, но и позволяет измерять и восстанавливать цикл клеточного цикла индукции и ремонта DSB, а также активацию caspase-3. Такие анализы были бы невозможны при независимо множетесь анализы, но они весьма актуальны для всестороннего понимания реакции повреждения ДНК после генотоксического стресса. Многие противораковые препараты, такие как цитостатические соединения, направлены против деления клеток, и их эффективность сильно зависит от стадии клеточного цикла. Наличие различных процессов ремонта DSB также зависит от стадии цикла ячейки и выбора пути, который имеет решающее значение для точности ремонта, и, в свою очередь, определяет судьбу ячейки9,10,11, 12. Кроме того, измерение уровня DSB в клеточном цикле является более точным, чем объединенный анализ, поскольку уровни DSB зависят не только от дозы генотоксического соединения или радиации, но и от содержания ДНК клетки.
Метод был использован для сравнения эффективности различных радиотерапий для преодоления механизмов сопротивления в глиобластоме13 и для вскрытия взаимодействия между ионизирующим излучением и целевыми препаратами при остеосаркоме14,15 и нетипичные тератоидные раки раков16. Кроме того, описанный метод был широко использован для анализа побочных эффектов радио- и химиотерапии на мезенхимальных стволовых клетках17,18,19,20,21, 22,23,24, которые необходимы для ремонта лечения индуцированных нормальных повреждений тканей и имеют потенциальное применение в регенеративной медицине.
Protocol
Representative Results
Discussion
Рекомендуемый метод прост в использовании и предлагает быстрое, точное и воспроизводимое измерение реакции повреждения ДНК, включая двухстротный разрыв (DSB) индукции и ремонта, эффекты клеточного цикла и апоптотические клеточные смерти. Сочетание этих конечных точек обеспечивает бол?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим команду Flow Cytometry Facility в Немецком онкологическом научно-исследовательском центре (DKF) за их поддержку.
Materials
| 1000 µL filter tips | Nerbe plus | 07-693-8300 | |
| 100-1000 µL pipette | Eppendorf | 3123000063 | |
| 12 x 75 mm Tubes with Cell Strainer Cap, 35 µm mesh pore size | BD Falcon | 352235 | |
| 15 mL tubes | BD Falcon | 352096 | |
| 200 µL filter tips | Nerbe plus | 07-662-8300 | |
| 20-200 µL pipette | Eppendorf | 3123000055 | |
| 4’,6-Diamidin-2-phenylindol (DAPI) | Sigma-Aldrich | D9542 | Dissolve in water at 200 µg/ml and store aliquots at -20 °C |
| Alexa Fluor 488 anti-H2A.X Phospho (Ser139) Antibody, RRID: AB_2248011 | BioLegend | 613406 | Dilute 1:20 |
| Alexa Fluor 647 Rabbit Anti-Active Caspase-3 Antibody, AB_1727414 | BD Pharmingen | 560626 | Dilute 1:20 |
| BD FACSClean solution | BD Biosciences | 340345 | For cytometer cleaning routine after measurement |
| BD FACSRinse solution | BD Biosciences | 340346 | For cytometer cleaning routine after measurement |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (PBS) | Biochrom | L 182 | Dissolve in water to 1x concentration |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium with stable glutamin | Biochrom | FG 0415 | Routine cell culture material for the example cell line used in the protocol |
| Ethanol absolute | VWR | 20821.330 | |
| Excel software | Microsoft | ||
| FBS Superior (fetal bovine serum) | Biochrom | S 0615 | Routine cell culture material for the example cell line used in the protocol |
| FlowJo v10 software | LLC | online order | |
| Fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-01 | Embedding medium for optional preparation of microscopic slides from stained samples |
| folded cellulose filters, grade 3hw | NeoLab | 11416 | |
| LSRII or LSRFortessa cytometer | BD Biosciences | ||
| MG132 | Calbiochem | 474787 | optional drug for apoptosis positive control |
| Multifuge 3SR+ | Heraeus | ||
| Paraformaldehyde | AppliChem | A3813 | Prepare 4.5% solution fresh. Dilute in PBS by heating to 80 °C with slow stirring under the fume hood. Cover the flask with aluminium foil to prevent heat loss. Let the solution cool to room temperature and adjust the final volume. Pass the solution through a cellulose filter. |
| Phospho-Histone H3 (Ser10) (D2C8) XP Rabbit mAb (Alexa Fluor® 555 Conjugate) RRID: AB_10694639 | Cell Signaling Technology | #3475 | Dilute 3:200 |
| PIPETBOY acu 2 | Integra Biosciences | 155 016 | |
| Serological pipettes, 10 mL | Corning | 4488 | |
| Serological pipettes, 25 mL | Corning | 4489 | |
| Serological pipettes, 5 mL | Corning | 4487 | |
| SuperKillerTRAIL (modified TNF-related apoptosis-inducing ligand) | Biomol | AG-40T-0002-C020 | optional drug for apoptosis positive control |
| T25 cell culture flasks | Greiner bio-one | 690160 | Routine cell culture material for the example cell line used in the protocol |
| Trypsin/EDTA | PAN Biotech | P10-025500 | Routine cell culture material for the example cell line used in the protocol |
| U87 MG glioblastoma cells | ATCC | ATCC-HTB-14 | Example cell line used in the protocol |
References
- Jensen, A., et al. Treatment of non-small cell lung cancer with intensity-modulated radiation therapy in combination with cetuximab: the NEAR protocol (NCT00115518). BMC Cancer. 6, 122 (2006).
- Oertel, S., et al. Human Glioblastoma and Carcinoma Xenograft Tumors Treated by Combined Radiation and Imatinib (Gleevec). Strahlentherapie und Onkologie. 182 (7), 400-407 (2006).
- Timke, C., et al. Combination of Vascular Endothelial Growth Factor Receptor/Platelet-Derived Growth Factor Receptor Inhibition Markedly Improves Radiation Tumor Therapy. Clinical Cancer Research. 14 (7), 2210-2219 (2008).
- Zhang, M., et al. Trimodal glioblastoma treatment consisting of concurrent radiotherapy, temozolomide, and the novel TGF-β receptor I kinase inhibitor LY2109761. Neoplasia. 13 (6), 537-549 (2011).
- Blattmann, C., et al. Suberoylanilide hydroxamic acid affects expression in osteosarcoma, atypical teratoid rhabdoid tumor and normal tissue cell lines after irradiation. Strahlentherapie und Onkologie. 188 (2), 168-176 (2012).
- Hoeijmakers, J. H. DNA Damage, Aging, and Cancer. New England Journal of Medicine. 361 (15), 1475-1485 (2015).
- Rodgers, K., McVey, M. Error-Prone Repair of DNA Double-Strand Breaks. Journal of Cellular Physiology. 231 (1), 15-24 (2016).
- Ciccia, A., Elledge, S. J. The DNA Damage Response: Making It Safe to Play with Knives. Molecular Cell. 40 (2), 179-204 (2010).
- Rothkamm, K., Krüger, I., Thompson, L. H., Löbrich, M. Pathways of DNA double-strand break repair during the mammalian cell cycle. Molecular and Cellular Biology. 23 (16), 5706-5715 (2003).
- Escribano-Díaz, C., et al. A Cell Cycle-Dependent Regulatory Circuit Composed of 53BP1-RIF1 and BRCA1-CtIP Controls DNA Repair Pathway Choice. Molecular Cell. 49 (5), 872-883 (2013).
- Bakr, A., et al. Functional crosstalk between DNA damage response proteins 53BP1 and BRCA1 regulates double strand break repair choice. Radiotherapy and Oncology. 119 (2), 276-281 (2015).
- Mladenov, E., Magin, S., Soni, A., Iliakis, G. DNA double-strand-break repair in higher eukaryotes and its role in genomic instability and cancer: Cell cycle and proliferation-dependent regulation. Seminars in Cancer Biology. 37-38, 51-64 (2016).
- Lopez Perez, R., et al. DNA damage response of clinical carbon ion versus photon radiation in human glioblastoma cells. Radiotherapy and Oncology. 133, 77-86 (2019).
- Oertel, S., et al. Combination of suberoylanilide hydroxamic acid with heavy ion therapy shows promising effects in infantile sarcoma cell lines. Radiation oncology. 6 (1), 119 (2011).
- Blattmann, C., et al. Suberoylanilide hydroxamic acid affects γH2AX expression in osteosarcoma, atypical teratoid rhabdoid tumor and normal tissue cell lines after irradiation. Strahlentherapie und Onkologie. 188 (2), 168-176 (2012).
- Thiemann, M., et al. In vivo efficacy of the histone deacetylase inhibitor suberoylanilide hydroxamic acid in combination with radiotherapy in a malignant rhabdoid tumor mouse model. Radiation Oncology. 7 (1), 52 (2012).
- Nicolay, N. H., et al. Mesenchymal stem cells retain their defining stem cell characteristics after exposure to ionizing radiation. International Journal of Radiation Oncology Biology Physics. 87 (5), 1171-1178 (2013).
- Nicolay, N. H., et al. Mesenchymal stem cells are resistant to carbon ion radiotherapy. Oncotarget. 6 (4), 2076-2087 (2015).
- Nicolay, N. H., et al. Mesenchymal stem cells exhibit resistance to topoisomerase inhibition. Cancer letters. 374 (1), 75-84 (2016).
- Nicolay, N. H., et al. Mesenchymal stem cells maintain their defining stem cell characteristics after treatment with cisplatin. Scientific Reports. 6, 20035 (2016).
- Nicolay, N. H., et al. Mesenchymal stem cells are sensitive to bleomycin treatment. Scientific Reports. 6, 26645 (2016).
- Rühle, A., et al. Cisplatin radiosensitizes radioresistant human mesenchymal stem cells. Oncotarget. 8 (50), 87809-87820 (2017).
- Münz, F., et al. Human mesenchymal stem cells lose their functional properties after paclitaxel treatment. Scientific Reports. 8 (1), 312 (2018).
- Rühle, A., et al. The Radiation Resistance of Human Multipotent Mesenchymal Stromal Cells Is Independent of Their Tissue of Origin. International Journal of Radiation Oncology Biology Physics. 100 (5), 1259-1269 (2018).
- Dean, P. N., Jett, J. H. Mathematical analysis of DNA distributions derived from flow microfluorometry. Journal of Cell Biology. 60 (2), 523-527 (1974).
- Fox, M. H. A model for the computer analysis of synchronous DNA distributions obtained by flow cytometry. Cytometry. 1 (1), 71-77 (1980).
- Costes, S. V., Boissière, A., Ravani, S., Romano, R., Parvin, B., Barcellos-Hoff, M. H. Imaging features that discriminate between foci induced by high- and low-LET radiation in human fibroblasts. Radiation Research. 165 (5), 505-515 (2006).
- Meyer, B., Voss, K. -. O., Tobias, F., Jakob, B., Durante, M., Taucher-Scholz, G. Clustered DNA damage induces pan-nuclear H2AX phosphorylation mediated by ATM and DNA-PK. Nucleic Acids Research. 41 (12), 6109-6118 (2013).
- Lopez Perez, R., et al. Superresolution light microscopy shows nanostructure of carbon ion radiation-induced DNA double-strand break repair foci. FASEB. 30 (8), 2767-2776 (2016).
- Schipler, A., Iliakis, G. DNA double-strand-break complexity levels and their possible contributions to the probability for error-prone processing and repair pathway choice. Nucleic Acids Research. 41 (16), 7589-7605 (2013).
- Stenerlow, B., Hoglund, E., Carlsson, J. DNA fragmentation by charged particle tracks. Advances in Space Research. 30 (4), 859-863 (2002).
- Friedland, W., et al. Comprehensive track-structure based evaluation of DNA damage by light ions from radiotherapy-relevant energies down to stopping. Scientific Reports. 7, 45161 (2017).
- Pang, D., Chasovskikh, S., Rodgers, J. E., Dritschilo, A. Short DNA Fragments Are a Hallmark of Heavy Charged-Particle Irradiation and May Underlie Their Greater Therapeutic Efficacy. Frontiers in Oncology. 6, 130 (2016).
- Böcker, W., Iliakis, G. Computational Methods for analysis of foci: validation for radiation-induced gamma-H2AX foci in human cells. Radiation Research. 165 (1), 113-124 (2006).
- Löbrich, M., et al. γH2AX foci analysis for monitoring DNA double-strand break repair: Strengths, limitations and optimization. Cell Cycle. 9 (4), 662-669 (2010).
