Celle cyklus-specifik måling af γH2AX og apoptose efter genotoksisk stress ved flow cytometri
Summary
Den præsenterede metode kombinerer den kvantitative analyse af DNA dobbelt-streng pauser (DSBs), celle cyklus distribution og apoptose at muliggøre celle cyklus-specifik evaluering af DSB induktion og reparation samt konsekvenserne af reparation fiasko.
Abstract
Den præsenterede metode eller let modificerede versioner er blevet udtænkt for at studere specifikke behandling svar og bivirkninger af forskellige anti-cancer behandlinger som anvendes i klinisk onkologi. Det muliggør en kvantitativ og langsgående analyse af DNA-skade respons efter genotoksisk stress, som induceret af strålebehandling og et væld af anti-cancer-lægemidler. Metoden dækker alle stadier af DNA-skade respons, der giver endepunkter for induktion og reparation af DNA dobbelt-streng pauser (DSBs), celle cyklus anholdelse og celledød ved apoptose i tilfælde af reparation fiasko. Kombinationen af disse målinger giver oplysninger om celle cyklus afhængige behandlingseffekter og giver således mulighed for en dybtgående undersøgelse af samspillet mellem cellulær spredning og håndterings mekanismer mod DNA-skader. Da virkningen af mange kræft terapeutiske stoffer, herunder kemoterapeutika og ioniserende stråling, er begrænset til eller stærkt varierende i henhold til specifikke celle cyklus faser, er de korrelative analyser baseret på en robust og gennemførlig metode til at vurdere behandlingseffekterne på DNA i en celle cyklus-specifik måde. Dette er ikke muligt med enkeltpunkts-assays og en vigtig fordel ved den præsenterede metode. Metoden er ikke begrænset til en bestemt cellelinje og er blevet grundigt testet i et væld af tumor og normale vævs cellelinjer. Det kan anvendes bredt som en omfattende genotoksicitet analyse på mange områder af onkologi foruden radio-onkologi, herunder miljø risikofaktor vurdering, Drug screening og evaluering af genetisk ustabilitet i tumorceller.
Introduction
Målet med onkologi er at dræbe eller at inaktivere kræftceller uden at skade normale celler. Mange terapier enten direkte eller indirekte inducere genotoksisk stress i kræftceller, men også til nogle udvide i normale celler. Kemoterapi eller målrettede lægemidler kombineres ofte med strålebehandling for at øge radio følsomheden af den bestrålede tumor1,2,3,4,5, hvilket giver mulighed for en reduktion af strålingsdosis for at minimere den normale vævsskade.
Ioniserende stråling og andre genotoksiske agenser fremkalder forskellige former for DNA-skade, herunder base modifikationer, streng deres og enkelt-eller dobbelt-streng pauser. DNA dobbelt-streng pauser (DSBs) er de mest alvorlige DNA-læsioner og deres induktion er nøglen til celle drab effekt af ioniserende stråling og forskellige cytostatiske lægemidler i radioterapi. DSBs ikke kun skade integriteten af genomet, men også fremme dannelsen af mutationer6,7. Derfor, forskellige DSB reparations veje, og mekanismer til at eliminere uopretteligt beskadigede celler som apoptose har udviklet sig under Evolution. Hele DNA-skade respons (DDR) reguleres af et komplekst netværk af signalerings veje, der rækker fra DNA-skade genkendelse og celle cyklus anholdelse for at muliggøre DNA-reparation, programmeret celledød eller inaktivering i tilfælde af reparations fejl8.
Den præsenterede flow cytometriske metode er blevet udviklet for at undersøge DDR efter genotoksisk stress i en omfattende analyse, der dækker DSB induktion og reparation, samt følgerne af reparations svigt. Den kombinerer målingen af den almindeligt anvendte DSB-markør γH2AX med analyse af cellecyklussen og induktion af apoptose ved hjælp af klassisk subG1 analyse og mere specifik evaluering af caspase-3-aktivering.
Kombinationen af disse endepunkter i en analyse reducerer ikke kun tid, arbejdskraft og omkostnings udgifter, men muliggør også celle cyklus specifik måling af DSB-induktion og-reparation samt caspase-3-aktivering. Sådanne analyser ville ikke være mulige med selvstændigt udførte assays, men de er yderst relevante for en omfattende forståelse af DNA-skade reaktionen efter genotoksisk stress. Mange anti-cancer medicin, såsom cytostatika, er rettet mod opdeling celler og deres effektivitet er stærkt afhængig af celle cyklus fase. Tilgængeligheden af forskellige DSB reparationsprocesser er også afhængig af celle cyklus fase og pathway valg, som er afgørende for reparation nøjagtighed, og til gengæld bestemmer skæbnen for cellen9,10,11, 12. Desuden er celle cyklus specifik måling af DSB-niveauerne mere nøjagtig end den samlede analyse, fordi DSB-niveauerne ikke kun afhænger af dosen af en genotoksisk forbindelse eller stråling, men også af cellens DNA-indhold.
Metoden er blevet anvendt til at sammenligne effekten af forskellige stråleterapeutiske midler til at overvinde resistensmekanismer i glioblastoma13 og til at dissekere samspillet mellem ioniserende stråling og målrettede læge stoffer i osteosarkom14,15 og atypiske teratoide karcinom Cancer16. Desuden, den beskrevne metode er blevet meget anvendt til at analysere bivirkninger af radio-og kemoterapi på mesenchymal stamceller17,18,19,20,21, 22,23,24, som er afgørende for reparation af behandling-induceret normal vævsskade og har en potentiel anvendelse i regenerativ medicin.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den featured metode er nem at bruge og tilbyder en hurtig, præcis og reproducerbar måling af DNA-skade respons herunder dobbelt-streng break (DSB) induktion og reparation, celle cyklus effekter og apoptotiske celledød. Kombinationen af disse endepunkter giver et mere fuldstændigt billede af deres indbyrdes relationer end individuelle analyser. Metoden kan anvendes bredt som en omfattende genotoksicitets analyse inden for strålings biologi, terapi og beskyttelse og mere generelt i onkologi (f. eks. til vurdering af m…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Flowcytometry Facility team på det tyske Cancer Research Center (DKFZ) for deres støtte.
Materials
| 1000 µL filter tips | Nerbe plus | 07-693-8300 | |
| 100-1000 µL pipette | Eppendorf | 3123000063 | |
| 12 x 75 mm Tubes with Cell Strainer Cap, 35 µm mesh pore size | BD Falcon | 352235 | |
| 15 mL tubes | BD Falcon | 352096 | |
| 200 µL filter tips | Nerbe plus | 07-662-8300 | |
| 20-200 µL pipette | Eppendorf | 3123000055 | |
| 4’,6-Diamidin-2-phenylindol (DAPI) | Sigma-Aldrich | D9542 | Dissolve in water at 200 µg/ml and store aliquots at -20 °C |
| Alexa Fluor 488 anti-H2A.X Phospho (Ser139) Antibody, RRID: AB_2248011 | BioLegend | 613406 | Dilute 1:20 |
| Alexa Fluor 647 Rabbit Anti-Active Caspase-3 Antibody, AB_1727414 | BD Pharmingen | 560626 | Dilute 1:20 |
| BD FACSClean solution | BD Biosciences | 340345 | For cytometer cleaning routine after measurement |
| BD FACSRinse solution | BD Biosciences | 340346 | For cytometer cleaning routine after measurement |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (PBS) | Biochrom | L 182 | Dissolve in water to 1x concentration |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium with stable glutamin | Biochrom | FG 0415 | Routine cell culture material for the example cell line used in the protocol |
| Ethanol absolute | VWR | 20821.330 | |
| Excel software | Microsoft | ||
| FBS Superior (fetal bovine serum) | Biochrom | S 0615 | Routine cell culture material for the example cell line used in the protocol |
| FlowJo v10 software | LLC | online order | |
| Fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-01 | Embedding medium for optional preparation of microscopic slides from stained samples |
| folded cellulose filters, grade 3hw | NeoLab | 11416 | |
| LSRII or LSRFortessa cytometer | BD Biosciences | ||
| MG132 | Calbiochem | 474787 | optional drug for apoptosis positive control |
| Multifuge 3SR+ | Heraeus | ||
| Paraformaldehyde | AppliChem | A3813 | Prepare 4.5% solution fresh. Dilute in PBS by heating to 80 °C with slow stirring under the fume hood. Cover the flask with aluminium foil to prevent heat loss. Let the solution cool to room temperature and adjust the final volume. Pass the solution through a cellulose filter. |
| Phospho-Histone H3 (Ser10) (D2C8) XP Rabbit mAb (Alexa Fluor® 555 Conjugate) RRID: AB_10694639 | Cell Signaling Technology | #3475 | Dilute 3:200 |
| PIPETBOY acu 2 | Integra Biosciences | 155 016 | |
| Serological pipettes, 10 mL | Corning | 4488 | |
| Serological pipettes, 25 mL | Corning | 4489 | |
| Serological pipettes, 5 mL | Corning | 4487 | |
| SuperKillerTRAIL (modified TNF-related apoptosis-inducing ligand) | Biomol | AG-40T-0002-C020 | optional drug for apoptosis positive control |
| T25 cell culture flasks | Greiner bio-one | 690160 | Routine cell culture material for the example cell line used in the protocol |
| Trypsin/EDTA | PAN Biotech | P10-025500 | Routine cell culture material for the example cell line used in the protocol |
| U87 MG glioblastoma cells | ATCC | ATCC-HTB-14 | Example cell line used in the protocol |
References
- Jensen, A., et al. Treatment of non-small cell lung cancer with intensity-modulated radiation therapy in combination with cetuximab: the NEAR protocol (NCT00115518). BMC Cancer. 6, 122 (2006).
- Oertel, S., et al. Human Glioblastoma and Carcinoma Xenograft Tumors Treated by Combined Radiation and Imatinib (Gleevec). Strahlentherapie und Onkologie. 182 (7), 400-407 (2006).
- Timke, C., et al. Combination of Vascular Endothelial Growth Factor Receptor/Platelet-Derived Growth Factor Receptor Inhibition Markedly Improves Radiation Tumor Therapy. Clinical Cancer Research. 14 (7), 2210-2219 (2008).
- Zhang, M., et al. Trimodal glioblastoma treatment consisting of concurrent radiotherapy, temozolomide, and the novel TGF-β receptor I kinase inhibitor LY2109761. Neoplasia. 13 (6), 537-549 (2011).
- Blattmann, C., et al. Suberoylanilide hydroxamic acid affects expression in osteosarcoma, atypical teratoid rhabdoid tumor and normal tissue cell lines after irradiation. Strahlentherapie und Onkologie. 188 (2), 168-176 (2012).
- Hoeijmakers, J. H. DNA Damage, Aging, and Cancer. New England Journal of Medicine. 361 (15), 1475-1485 (2015).
- Rodgers, K., McVey, M. Error-Prone Repair of DNA Double-Strand Breaks. Journal of Cellular Physiology. 231 (1), 15-24 (2016).
- Ciccia, A., Elledge, S. J. The DNA Damage Response: Making It Safe to Play with Knives. Molecular Cell. 40 (2), 179-204 (2010).
- Rothkamm, K., Krüger, I., Thompson, L. H., Löbrich, M. Pathways of DNA double-strand break repair during the mammalian cell cycle. Molecular and Cellular Biology. 23 (16), 5706-5715 (2003).
- Escribano-Díaz, C., et al. A Cell Cycle-Dependent Regulatory Circuit Composed of 53BP1-RIF1 and BRCA1-CtIP Controls DNA Repair Pathway Choice. Molecular Cell. 49 (5), 872-883 (2013).
- Bakr, A., et al. Functional crosstalk between DNA damage response proteins 53BP1 and BRCA1 regulates double strand break repair choice. Radiotherapy and Oncology. 119 (2), 276-281 (2015).
- Mladenov, E., Magin, S., Soni, A., Iliakis, G. DNA double-strand-break repair in higher eukaryotes and its role in genomic instability and cancer: Cell cycle and proliferation-dependent regulation. Seminars in Cancer Biology. 37-38, 51-64 (2016).
- Lopez Perez, R., et al. DNA damage response of clinical carbon ion versus photon radiation in human glioblastoma cells. Radiotherapy and Oncology. 133, 77-86 (2019).
- Oertel, S., et al. Combination of suberoylanilide hydroxamic acid with heavy ion therapy shows promising effects in infantile sarcoma cell lines. Radiation oncology. 6 (1), 119 (2011).
- Blattmann, C., et al. Suberoylanilide hydroxamic acid affects γH2AX expression in osteosarcoma, atypical teratoid rhabdoid tumor and normal tissue cell lines after irradiation. Strahlentherapie und Onkologie. 188 (2), 168-176 (2012).
- Thiemann, M., et al. In vivo efficacy of the histone deacetylase inhibitor suberoylanilide hydroxamic acid in combination with radiotherapy in a malignant rhabdoid tumor mouse model. Radiation Oncology. 7 (1), 52 (2012).
- Nicolay, N. H., et al. Mesenchymal stem cells retain their defining stem cell characteristics after exposure to ionizing radiation. International Journal of Radiation Oncology Biology Physics. 87 (5), 1171-1178 (2013).
- Nicolay, N. H., et al. Mesenchymal stem cells are resistant to carbon ion radiotherapy. Oncotarget. 6 (4), 2076-2087 (2015).
- Nicolay, N. H., et al. Mesenchymal stem cells exhibit resistance to topoisomerase inhibition. Cancer letters. 374 (1), 75-84 (2016).
- Nicolay, N. H., et al. Mesenchymal stem cells maintain their defining stem cell characteristics after treatment with cisplatin. Scientific Reports. 6, 20035 (2016).
- Nicolay, N. H., et al. Mesenchymal stem cells are sensitive to bleomycin treatment. Scientific Reports. 6, 26645 (2016).
- Rühle, A., et al. Cisplatin radiosensitizes radioresistant human mesenchymal stem cells. Oncotarget. 8 (50), 87809-87820 (2017).
- Münz, F., et al. Human mesenchymal stem cells lose their functional properties after paclitaxel treatment. Scientific Reports. 8 (1), 312 (2018).
- Rühle, A., et al. The Radiation Resistance of Human Multipotent Mesenchymal Stromal Cells Is Independent of Their Tissue of Origin. International Journal of Radiation Oncology Biology Physics. 100 (5), 1259-1269 (2018).
- Dean, P. N., Jett, J. H. Mathematical analysis of DNA distributions derived from flow microfluorometry. Journal of Cell Biology. 60 (2), 523-527 (1974).
- Fox, M. H. A model for the computer analysis of synchronous DNA distributions obtained by flow cytometry. Cytometry. 1 (1), 71-77 (1980).
- Costes, S. V., Boissière, A., Ravani, S., Romano, R., Parvin, B., Barcellos-Hoff, M. H. Imaging features that discriminate between foci induced by high- and low-LET radiation in human fibroblasts. Radiation Research. 165 (5), 505-515 (2006).
- Meyer, B., Voss, K. -. O., Tobias, F., Jakob, B., Durante, M., Taucher-Scholz, G. Clustered DNA damage induces pan-nuclear H2AX phosphorylation mediated by ATM and DNA-PK. Nucleic Acids Research. 41 (12), 6109-6118 (2013).
- Lopez Perez, R., et al. Superresolution light microscopy shows nanostructure of carbon ion radiation-induced DNA double-strand break repair foci. FASEB. 30 (8), 2767-2776 (2016).
- Schipler, A., Iliakis, G. DNA double-strand-break complexity levels and their possible contributions to the probability for error-prone processing and repair pathway choice. Nucleic Acids Research. 41 (16), 7589-7605 (2013).
- Stenerlow, B., Hoglund, E., Carlsson, J. DNA fragmentation by charged particle tracks. Advances in Space Research. 30 (4), 859-863 (2002).
- Friedland, W., et al. Comprehensive track-structure based evaluation of DNA damage by light ions from radiotherapy-relevant energies down to stopping. Scientific Reports. 7, 45161 (2017).
- Pang, D., Chasovskikh, S., Rodgers, J. E., Dritschilo, A. Short DNA Fragments Are a Hallmark of Heavy Charged-Particle Irradiation and May Underlie Their Greater Therapeutic Efficacy. Frontiers in Oncology. 6, 130 (2016).
- Böcker, W., Iliakis, G. Computational Methods for analysis of foci: validation for radiation-induced gamma-H2AX foci in human cells. Radiation Research. 165 (1), 113-124 (2006).
- Löbrich, M., et al. γH2AX foci analysis for monitoring DNA double-strand break repair: Strengths, limitations and optimization. Cell Cycle. 9 (4), 662-669 (2010).
