JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Résultats
Discussion
Divulgations
Acknowledgements
Materials
References
Traduction automatique
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biologie

İki adımlı PCR ve Yeni Nesil 16S rRNA Gen Sıralaması Kullanarak Mikrobiyota Analizi

Published: October 15, 2019
doi:
10.3791/59980
, , ,
1Department of Pathology,University of Iowa, 2Medical Scientist Training Program,University of Iowa, 3Graduate Program in Immunology,University of Iowa, 4Graduate Program in Molecular Medicine,University of Iowa

Summary

Burada açıklanan serbestçe kullanılabilir araçları kullanarak 16S rRNA metagenomik sıralama ve analiz kullanarak mikrobiyom profilleme için basitleştirilmiş bir standart işletim prosedürüdür. Bu protokol mikrobiyom alanında yeni araştırmacılar yanı sıra daha yüksek bir çözünürlükte bakteriyel profilleme elde etmek için yöntemler güncellemeleri gerektiren yardımcı olacaktır.

Abstract

İnsan bağırsağı, gıda metabolizması, enerji hasadı ve bağışıklık sisteminin düzenlenmesi gibi fizyolojik işlevleri destekleyen trilyonlarca bakteri tarafından kolonize edilir. Sağlıklı bağırsak mikrobiyomu pertürbasyonu inflamatuar hastalıkların gelişiminde rol oynadığı ileri sürülmüştür, multipl skleroz da dahil olmak üzere (MS). Çevresel ve genetik faktörler mikrobiyomun bileşimini etkileyebilir; bu nedenle, bir hastalık fenotip ile bağlantılı mikrobiyal toplulukların belirlenmesi sağlık ve hastalık mikrobiyom rolünü tanımlama yolunda ilk adım haline gelmiştir. Bakteri topluluğunun profilini çıkarmak için 16S rRNA metagenomik diziliminin kullanılması mikrobiyom araştırmalarının ilerlemesine yardımcı olmuştur. Geniş kullanımına rağmen, 16S rRNA tabanlı taksonomik profilleme analizi için tek tip bir protokol yoktur. Başka bir sınırlama, daha küçük sıralama okumaları gibi teknik güçlükler nedeniyle taksonomik atamanın düşük çözünürlüğü ve ters (R2) okumanın düşük kalitesi nedeniyle son analizde yalnızca ileri (R1) okumaların kullanılmasıdır. Belirli bir biyonumunede bakteri çeşitliliğini karakterize etmek için yüksek çözünürlüğe sahip basitleştirilmiş bir yönteme ihtiyaç vardır. Sıralama teknolojisindeki gelişmeler, daha uzun okumaları yüksek çözünürlükte sıralayabilme özelliği yle bu zorlukların bazılarının üstesinden gelinmeye yardımcı oldu. R tabanlı Bölücü Amplicon Denoising Algoritma-2 (DADA2) gibi kamuya açık metagenomik analiz boru hattı ile birlikte mevcut sıralama teknolojisi, DADA2 cinste sıra atayabilirsiniz gibi, yüksek çözünürlükte mikrobiyal profilleme ilerlemeye yardımcı oldu ve tür düzeyleri. Burada açıklanan 16S rRNA geninin V3-V4 bölgesinin iki aşamalı amplifikasyon kullanarak bakteriyel profilleme gerçekleştirmek için bir rehber, serbestçe kullanılabilir analiz araçları kullanarak analiz takip (yani, DADA2, Phyloseq, ve METAGENassist). Bu basit ve tam iş akışı mikrobiyom profilleme çalışmaları gerçekleştirmek isteyen araştırmacılar için mükemmel bir araç olarak hizmet olacağına inanılmaktadır.

Introduction

Mikrobiyota belirli bir ortamda yaşayan mikroorganizmaların (bakteri, virüs, arke, bakteriyofaj ve mantarlar) bir koleksiyon anlamına gelir ve mikrobiyom yerleşik mikroorganizmaların kolektif genomu anlamına gelir. Bakteriler insanlarda ve farelerde en bol mikroplardan biri olduğundan, bu çalışma sadece bakteri profilleme üzerinde odaklanmıştır. İnsan bağırsağı trilyonlarca bakteri ve yüzlerce bakteri suşları tarafından kolonize edilir1. Normal bağırsak mikrobiyotası fonksiyonları düzenleyerek konaksağlıklı bir durumun korunmasında hayati bir rol oynar (yani, bozulmamış bir bağırsak bariyerinin bakımı, gıda metabolizması, enerji homeostaz, patojen organizmalar tarafından kolonizasyon inhibisyonu, ve bağışıklık yanıtlarının düzenlenmesi)2,3,4,5. Bağırsak mikrobiyotası (gut disbiyoz) bileşimsel pertürbasyonları gastrointestinal bozukluklar6, obezite7,8, inme9, kanser10dahil olmak üzere insan hastalıkları, bir dizi bağlantılı olmuştur diyabet8,11, romatoid artrit12, alerji13, ve multipl skleroz gibi merkezi sinir sistemi ile ilgili hastalıklar (MS)14,15 ve Alzheimer hastalık (AD)8,16. Bu nedenle, son yıllarda, farklı vücut sitelerinde bakteri bileşimi tanımlamak için araçlara ilgi artmıştır. Güvenilir bir yöntem, yüksek iş sahibi ve kullanımı kolay olmak, bakteriyel mikrobiyotayı yüksek çözünürlükle sınıflandırma yeteneğine sahip olmak ve düşük maliyetli olmak gibi özelliklere sahip olmalıdır.

Kültür tabanlı mikrobiyolojik teknikler tanımlamak ve kültürde büyümek için çeşitli bağırsak bakterilerin başarısızlığı nedeniyle karmaşık bağırsak mikrobiyom karakterize etmek için yeterince duyarlı değildir. Sıralama tabanlı teknolojinin gelişi, özellikle 16S rRNA tabanlı metagenomik sıralama, bu zorlukların bazılarının üstesinden geldi ve mikrobiyom araştırmadönüştürdü 17. Gelişmiş 16S rRNA tabanlı sıralama teknolojisi insan sağlığında bağırsak mikrobiyomu için kritik bir rol kurulmasında yardımcı oldu. İnsan Mikrobiyom Projesi, Ulusal Sağlık Enstitüleri girişimi18, ve MetaHIT projesi (Bir Avrupa girişimi)19 hem mikrobiyom analizi için temel bir çerçeve kurulmasında yardımcı oldu. Bu girişimler, bağırsak mikrobiyomu’nun insan sağlığı ve hastalığındaki rolünü belirlemek için birden fazla çalışmanın başlatılmasına yardımcı oldu.

Bir dizi grup inflamatuar hastalığı olan hastalarda bağırsak disbiyoz göstermiştir12,14,15,20,21,22. Çok katlı ve düşük maliyetler nedeniyle taksonomik profilleme için yaygın olarak kullanılmasına rağmen, 16S rRNA tabanlı taksonomik profilleme için tek tip protokol bulunmamaktadır. Başka bir sınırlama daha küçük sıralama okuma (150 bp veya 250 bp) ve düşük kaliteli ters sıralama okuma (R2) nedeniyle sadece ileri sıralama okuma (R1) kullanımı nedeniyle taksonomik atama düşük çözünürlüğüdür. Ancak sıralama teknolojisindeki ilerlemeler, eşleştirilmiş uçlu okumaları (örneğin, Illumina MiSeq 2x300bp) kullanarak daha uzun okumaları sıralama yeteneği gibi bu zorlukların bazılarının üstesinden gelinmeye yardımcı oldu.

Mevcut sıralama teknolojisi r1 ve R2 okumabirleştirilmesine olanak sağlayan 600 bp kaliteli okuma, sıralayabilirsiniz. Bu birleştirilmiş daha uzun R1 ve R2 okumaları, özellikle açık erişimli R tabanlı Bölücü Amplicon Paylaştırma Algoritması-2 (DADA2) platformuile daha iyi taksonomik atamalara olanak sağlar. DADA2, QIIME23tarafından kullanılan %97 benzerliğe dayalı operasyonel taksonomik birim (OTU) atamaları yerine amplicon dizi varyantı (ASV) tabanlı atamalar kullanmaktadır. ASV eşleşmeleri, 1-2 nükleotit içinde veritabanında tam bir dizi eşleşmesi ile sonuçlanır ve bu da cins ve tür düzeylerinde atamaya yol açar. Böylece, daha uzun, kaliteli eşleştirilmiş uçlu okumalar ve daha iyi taksonomik atama araçlarının (DADA2 gibi) birleşimi mikrobiyom çalışmalarını dönüştürmüştür.

Burada 16S rRNA V3-V4 bölgenin iki adım amplifikasyon ve DADA2, Phyloseq ve METAGENassist boru hatları kullanarak veri analizi kullanarak bakteriyel profilleme gerçekleştirmek için bir adım-adım kılavuzdur. Bu çalışmada, insan lökosit antijeni (HLA) sınıf II transgenik fareler kullanılır, bazı HLA sınıf II alelleri MS20gibi otoimmün hastalıklara yatkınlık ile bağlantılı olduğu gibi,24,25. Ancak, bağırsak mikrobiyotasının bileşimini düzenleyen HLA sınıf II genlerinin önemi bilinmemektedir. HLA sınıf II molekülünün belirli bakteriler için seçerek bağırsak mikrobiyal topluluğunu etkileyeceği varsayımında dır. Majör histokompatibilite kompleksi (MHC) sınıf II nakavt fareler (AE.KO) veya insan HLA-DQ8 moleküllerini ifade eden fareler (HLA-DQ8)24,25,26 HLA sınıfı II moleküllerinin önemini anlamak için kullanılmıştır. bağırsak mikrobiyal topluluk şekillendirme. Bu R tabanlı veri analizi ile bu tam ve basitleştirilmiş iş akışı mikrobiyom profilleme çalışmaları gerçekleştirmek isteyen araştırmacılar için mükemmel bir araç olarak hizmet olacağına inanılmaktadır.

Endojen murine MHC sınıfı II genleri (AE.KO) ve AE-/-yoksun farelerin üretimi . HLA-DQA1*0103, DQB1*0302 (HLA-DQ8) C57BL/6J arka planlı transgenik fareler daha önce26tanımlanmıştır. Dışkı örnekleri her iki cinsten (8-12 haftalık) farelerden toplanır. Fareler daha önce NIH ve kurumsal kurallar uyarınca Iowa Üniversitesi hayvan tesisinde yetiştirildi ve bakımını yapıyordu. Laminar akış dolabı içinde farelerin kesilmesi, farklı fare suşları arasında eldiven lerin değiştirilmesi ve farelerin düzgün bakımı gibi kontaminasyon kontrol stratejileri bağırsak mikrobiyomu profilleme için kritik adımlardır.

Uygun kişisel koruyucu ekipman (PPE) şiddetle tüm prosedür sırasında tavsiye edilir. DNA izolasyonu, PCR1 ve PCR2 amplifikasyonve sıralama adımları gerçekleştirirken uygun negatif kontroller eklenmelidir. Steril, DNase içermeyen, RNase içermeyen ve pirojen içermeyen malzemelerin kullanılması tavsiye edilir. Protokol boyunca mikrobiyom çalışmaları için belirlenmiş pipettor ve filtrelenmiş pipet uçları kullanılmalıdır. Mikrobiyota analizi yedi adımdan oluşur: 1) dışkı numunetoplama ve işleme; 2) DNA çıkarma; 3) 16S rRNA gen amplifikasyonu; 4) DNA kitaplığı yapı indeksli PCR kullanarak; 5) temizleme ve dizinlenmiş PCR (kütüphane) niceliksel; 6) MiSeq sıralaması; ve 7) veri işleme ve dizi analizi. Tüm protokol adımlarının şematik diyagramı Şekil 1’degösterilmiştir.

Protocol

Protokol Iowa Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylandı. 1. Dışkı Numunesi Toplama ve Taşıma Bölücü kutularını sterilize edin (bkz. Malzemeler Tablosu, Ek Şekil 1) etanol ile. Numune kimliği ve tedavi grubu (varsa) ile ön etiketli mikrosantrifüj tüpleri (fare başına bir) Fareleri sterilize edilmiş bölücü kutularına yerleştirin ve normal olarak 1 saate kadar dışk?…

Representative Results

MHC sınıf II molekülleri (insanlarda HLA) adaptif bağışıklık yanıtı merkezi oyuncular ve MS24,25,26bir yatkınlık ile güçlü dernekler göstermek gibi, bu HLA sınıf II molekülü hipotez oldu bağırsak mikrobiyal bileşimini etkiler. Bu nedenle, MHC sınıf II geni (AE.KO) veya insan HLA-DQ8 geni (HLA-DQ8) ifade eksikliği fareler bağırsak mikrobiyal topluluk şekillendirmede HLA sınıf II moleküllerinin öne…

Discussion

Açıklanan protokol basittir ve çok sayıda biyonumuneden 16S rRNA metagenomik sıralama kullanarak mikrobiyom profilleme gerçekleştirmek için kolay takip edilen adımlar vardır. Yeni nesil sıralama mikrobiyal ekoloji çalışmaları dönüştürdü, özellikle insan ve pre-klinik hastalık modelleri31,32. Bu tekniğin en büyük avantajı, belirli bir biyonumunede karmaşık mikrobiyal bileşimleri (culturable ve un-culturable mikroplar) yüksek bir veri …

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Yazarlar NIAID / NIH (1R01AI137075-01), Carver Trust Tıbbi Araştırma Girişimi Hibe ve University of Iowa Çevre Sağlığı Bilimleri Araştırma Merkezi, NIEHS / NIH (P30 ES005605) gelen finansman kabul.

Materials

1.5 ml Natural Microcentriguge Tube USA, Scientific 1615-5500 Fecal collection
3M hand applicator squeegee PA1-G 3M, MN, US 7100038651 Squeeger for proper sealing of PCR Plate
Agencourt AMPure XP Beckman Coulter, IN, USA A63880 PCR Purification, NGS Clean-up, PCR clean-up
Agilent DNA 1000 REAGENT Agilent Technologies, CA, USA 5067-1504 DNA quantification and quality control
Bioanalyzer DNA 1000 chip Agilent Technologies, CA, USA 5067-1504 DNA quantification and quality control
Index Adopter Replacement Caps Illumina, Inc., CA, USA 15026762 New cap for Index 1 and 2 adopter primer
DNeasy PowerLyzer PowerSoil Kit MoBio now part of QIAGEN, Valencia, CA, USA 12855-100 DNA isolation
KAPA HiFi HotStart ReadyMiX (2X) Kapa Biosystem, MA, USA KK2602 PCR ready mix for Amplicon PCR1 and Indexed PCR2
Lewis Divider Boxes Lewis Bins, WI, US ND03080 Fecal collection
Magnetic stand New England BioLabs, MA, USA S1509S For PCR clean-up
MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific, CA, USA 4346906 PCR Plate
MicroAmp Optical Adhesive Film Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific, CA, USA 4311971 PCR Plate Sealer
Microfuge 20 Centrifuge Beckman Coulter, IN, USA B30154 Centrifuge used for DNA isolation
MiSeq Reagent Kit (600 cycles)v.3 Illumina, Inc., CA, USA MS-102-3003 For MiSeq Sequencing
Nextera XT DNA Library Preparation Kit Illumina, Inc., CA, USA FC-131-1001 16S rRNA DNA Library Preparation
Reagent Reservoirs Multichannel Trays ASI, FL,USA RS71-1 For Pooling of PCR2 Product
Plate Cetrifuge Thermo Fisher Scientific, CA, USA 75004393 For PCR reagent mixing and removing air bubble from Plate
PhiX Control Illumina, Inc., CA, USA FC-110-3001 For MiSeq Sequencing control
Microbiome DNA Purification Kit Thermo Fisher Scientific, CA, USA A29789 For purification of PCR1 product
PowerLyzer 24 Homogenizer Omni International, GA, USA 19-001 Bead beater for DNA Isolation
Qubit dsDNA HS (High Sensitivity) assay kit Thermo Fisher Scientific, CA, USA Q32854 DNA quantification
TruSeq Index Plate Fixture Illumina, Inc., CA, USA FC-130-1005 For Arranging of the index primers
Vertical Dividers (large) Lewis Bins, WI, US DV-2280 Fecal collection
Vertical Dividers (small) Lewis Bins, WI, US DV-1780 Fecal collection
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lynch, S. V., Pedersen, O. The Human Intestinal Microbiome in Health and Disease. New England Journal of Medicine. 375 (24), 2369-2379 (2016).
  2. Blacher, E., Levy, M., Tatirovsky, E., Elinav, E. Microbiome-Modulated Metabolites at the Interface of Host Immunity. Journal of Immunology. 198 (2), 572-580 (2017).
  3. Jarchum, I., Pamer, E. G. Regulation of innate and adaptive immunity by the commensal microbiota. Current Opinion in Immunology. 23 (3), 353-360 (2011).
  4. Rescigno, M. The intestinal epithelial barrier in the control of homeostasis and immunity. Trends in Immunology. 32 (6), 256-264 (2011).
  5. Zhang, K., Hornef, M. W., Dupont, A. The intestinal epithelium as guardian of gut barrier integrity. Cell Microbiology. 17 (11), 1561-1569 (2015).
  6. Ghoshal, U. C., Park, H., Gwee, K. A. Bugs and irritable bowel syndrome: The good, the bad and the ugly. Journal of Gastroenterology and Hepatology. 25 (2), 244-251 (2010).
  7. Ley, R. E., Turnbaugh, P. J., Klein, S., Gordon, J. I. Microbial ecology: human gut microbes associated with obesity. Nature. 444 (7122), 1022-1023 (2006).
  8. Naseer, M. I., et al. Role of gut microbiota in obesity, type 2 diabetes and Alzheimer’s disease. CNS & Neurological Disorders – Drug Targets. 13 (2), 305-311 (2014).
  9. Yin, J., et al. Dysbiosis of Gut Microbiota With Reduced Trimethylamine-N-Oxide Level in Patients With Large-Artery Atherosclerotic Stroke or Transient Ischemic Attack. Journal of American Heart Association. 4 (11), (2015).
  10. Azcarate-Peril, M. A., Sikes, M., Bruno-Barcena, J. M. The intestinal microbiota, gastrointestinal environment and colorectal cancer: a putative role for probiotics in prevention of colorectal cancer. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 301 (3), 401-424 (2011).
  11. Su, M., et al. Diversified gut microbiota in newborns of mothers with gestational diabetes mellitus. PLoS ONE. 13 (10), 0205695 (2018).
  12. Horta-Baas, G., et al. Intestinal Dysbiosis and Rheumatoid Arthritis: A Link between Gut Microbiota and the Pathogenesis of Rheumatoid Arthritis. Journal of Immunological Research. , 4835189 (2017).
  13. Panzer, A. R., Lynch, S. V. Influence and effect of the human microbiome in allergy and asthma. Current Opinion in Rheumatology. 27 (4), 373-380 (2015).
  14. Chen, J., et al. Multiple sclerosis patients have a distinct gut microbiota compared to healthy controls. Science Reports. 6, 28484 (2016).
  15. Tremlett, H., et al. Gut microbiota composition and relapse risk in pediatric MS: A pilot study. Journal of Neurological Science. 363, 153-157 (2016).
  16. Pistollato, F., et al. Role of gut microbiota and nutrients in amyloid formation and pathogenesis of Alzheimer disease. Nutritional Reviews. 74 (10), 624-634 (2016).
  17. Caporaso, J. G., et al. Global patterns of 16S rRNA diversity at a depth of millions of sequences per sample. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 108, 4516-4522 (2011).
  18. Turnbaugh, P. J., et al. The human microbiome project. Nature. 449 (7164), 804-810 (2007).
  19. Dusko Ehrlich, S. Meta, H.I.T.c. Metagenomics of the intestinal microbiota: potential applications. Gastroenterologie Clinique et Biologique. 34, 23-28 (2010).
  20. Jangi, S., et al. Alterations of the human gut microbiome in multiple sclerosis. Nature Communications. 7, 12015 (2016).
  21. Miyake, S., et al. Dysbiosis in the Gut Microbiota of Patients with Multiple Sclerosis, with a Striking Depletion of Species Belonging to Clostridia XIVa and IV Clusters. PLoS ONE. 10 (9), 0137429 (2015).
  22. Shahi, S. K., Freedman, S. N., Mangalam, A. K. Gut microbiome in multiple sclerosis: The players involved and the roles they play. Gut Microbes. 8 (6), 607-615 (2017).
  23. Callahan, B. J., et al. DADA2: High-resolution sample inference from Illumina amplicon data. Nature Methods. 13 (7), 581-583 (2016).
  24. Das, P., et al. Complementation between specific HLA-DR and HLA-DQ genes in transgenic mice determines susceptibility to experimental autoimmune encephalomyelitis. Human Immunology. 61 (3), 279-289 (2000).
  25. Mangalam, A. K., Rajagopalan, G., Taneja, V., David, C. S. HLA class II transgenic mice mimic human inflammatory diseases. Advances in Immunology. 97, 65-147 (2008).
  26. Mangalam, A., et al. HLA-DQ8 (DQB1*0302)-restricted Th17 cells exacerbate experimental autoimmune encephalomyelitis in HLA-DR3-transgenic mice. Journal of Immunology. 182 (8), 5131-5139 (2009).
  27. Kiernan, M. G., et al. The Human Mesenteric Lymph Node Microbiome Differentiates Between Crohn’s Disease and Ulcerative Colitis. Journal of Crohn’s & Colitis. 13 (1), 58-66 (2019).
  28. McMurdie, P. J., Holmes, S. phyloseq: an R package for reproducible interactive analysis and graphics of microbiome census data. PLoS ONE. 8 (4), 61217 (2013).
  29. Arndt, D., et al. METAGENassist: a comprehensive web server for comparative metagenomics. Nucleic Acids Research. 40, 88-95 (2012).
  30. Hugerth, L. W., Andersson, A. F. Analysing Microbial Community Composition through Amplicon Sequencing: From Sampling to Hypothesis Testing. Frontiers in Microbiology. 8, 1561 (2017).
  31. Srinivasan, R., et al. Use of 16S rRNA gene for identification of a broad range of clinically relevant bacterial pathogens. PLoS ONE. 10 (2), 0117617 (2015).
  32. Didelot, X., Bowden, R., Wilson, D. J., Peto, T. E. A., Crook, D. W. Transforming clinical microbiology with bacterial genome sequencing. Nature Reviews Genetics. 13 (9), 601-612 (2012).
  33. Buermans, H. P., den Dunnen, J. T. Next generation sequencing technology: Advances and applications. Biochimica et Biophysica Acta. 1842 (10), 1932-1941 (2014).
  34. Cai, L., Ye, L., Tong, A. H., Lok, S., Zhang, T. Biased diversity metrics revealed by bacterial 16S pyrotags derived from different primer sets. PLoS ONE. 8 (1), 53649 (2013).
  35. Kuczynski, J., et al. Experimental and analytical tools for studying the human microbiome. Nature Reviews Genetics. 13 (1), 47-58 (2011).
  36. Mangalam, A., et al. Human Gut-Derived Commensal Bacteria Suppress CNS Inflammatory and Demyelinating Disease. Cell Reports. 20 (6), 1269-1277 (2017).
  37. Shahi, S. K., et al. Prevotella histicola, A Human Gut Commensal, Is as Potent as COPAXONE(R) in an Animal Model of Multiple Sclerosis. Frontiers in Immunology. 10, 462 (2019).
  38. Bliss, D. Z., et al. Comparison of subjective classification of stool consistency and stool water content. Journal of Wound Ostomy & Continence Nursing. 26 (3), 137-141 (1999).
  39. Kim, D., et al. Optimizing methods and dodging pitfalls in microbiome research. Microbiome. 5 (1), 52 (2017).
  40. Sinha, R., et al. Collecting Fecal Samples for Microbiome Analyses in Epidemiology Studies. Cancer Epidemiology, Biomarkers & Prevention. 25 (2), 407-416 (2016).
  41. Salonen, A., et al. Comparative analysis of fecal DNA extraction methods with phylogenetic microarray: effective recovery of bacterial and archaeal DNA using mechanical cell lysis. Journal of Microbiological Methods. 81 (2), 127-134 (2010).
  42. Santiago, A., et al. Processing faecal samples: a step forward for standards in microbial community analysis. BMC Microbiology. 14, 112 (2014).
  43. Glassing, A., Dowd, S. E., Galandiuk, S., Davis, B., Chiodini, R. J. Inherent bacterial DNA contamination of extraction and sequencing reagents may affect interpretation of microbiota in low bacterial biomass samples. Gut Pathogens. 8, 24 (2016).
  44. Salter, S. J., et al. Reagent and laboratory contamination can critically impact sequence-based microbiome analyses. BMC Biology. 12, 87 (2014).
  45. Weiss, S., et al. Tracking down the sources of experimental contamination in microbiome studies. Genome Biology. 15 (12), 564 (2014).
  46. Lozupone, C., Lladser, M. E., Knights, D., Stombaugh, J., Knight, R. UniFrac: an effective distance metric for microbial community comparison. ISME Journal. 5 (2), 169-172 (2011).
  47. Schloss, P. D. Evaluating different approaches that test whether microbial communities have the same structure. ISME Journal. 2 (3), 265-275 (2008).
  48. Xia, Y., Sun, J. Hypothesis Testing and Statistical Analysis of Microbiome. Genes & Diseases. 4 (3), 138-148 (2017).
  49. Malla, M. A., et al. Exploring the Human Microbiome: The Potential Future Role of Next-Generation Sequencing in Disease Diagnosis and Treatment. Frontiers in Immunology. 9, 2868 (2018).

Tags

Keywords: MicrobiomeMicrobiota16S RRNA Gene SequencingNext-generation SequencingFecal SampleDNA ExtractionPCRGut MicrobiomeMicrobial Profiling
check_url/fr/59980?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citer Cet Article
Shahi, S. K., Zarei, K., Guseva, N. V., Mangalam, A. K. Microbiota Analysis Using Two-step PCR and Next-generation 16S rRNA Gene Sequencing. J. Vis. Exp. (152), e59980, doi:10.3791/59980 (2019).
Télécharger la Citation
Réimpressions et Autorisations

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image