تحليل الكائنات المجهرية باستخدام ثنائي الخطوة PCR والجيل التالي من 16S rRNA التسلسل الجيني
Summary
وصف هنا هو اجراء التشغيل القياسية مبسطه لتشكيل الميكروبيوم باستخدام 16s rrna metagenomic التسلسل والتحليل باستخدام الاداات المتاحة بحريه. هذا البروتوكول سوف تساعد الباحثين الذين هم جديده في مجال الميكروبيوم وكذلك تلك التي تتطلب تحديثات علي أساليب لتحقيق التنميط البكتيرية في دقه اعلي.
Abstract
يتم استعمار الأمعاء البشرية من قبل تريليونات من البكتيريا التي تدعم الوظائف الفسيولوجية مثل الأيض الغذائي ، وحصاد الطاقة ، وتنظيم الجهاز المناعي. وقد اقترح اضطراب من الميكروبيوم الأمعاء صحية للعب دور في تطوير الامراض التهابيه ، بما في ذلك التصلب المتعدد (MS). العوامل البيئية والوراثية يمكن ان تؤثر علي تكوين microbiome; ولذلك ، أصبح تحديد المجتمعات الميكروبية المرتبطة بالنمط الظاهري للمرض الخطوة الاولي نحو تحديد دور الميكروبيوم في الصحة والمرض. وقد ساعد استخدام التسلسل metagenomic 16s rrna لتنميط المجتمع البكتيرية في النهوض بالبحوث الميكروبيوم. وعلي الرغم من استخدامها علي نطاق واسع ، لا يوجد بروتوكول موحد لتحليل التنميط القائم علي التصنيف المستند إلى rRNA في 16 ثانيه. وهناك قيد آخر هو الدقة المنخفضة للتعيين التصنيفي بسبب الصعوبات التقنية مثل قراءه التسلسل الأصغر ، بالاضافه إلى استخدام المستقبل فقط (R1) يقرا في التحليل النهائي نظرا لتدني جوده القراءة (R2). هناك حاجه لطريقه مبسطه مع دقه عاليه لتوصيف التنوع البكتيري في معين الحيوية. وقد ساعدت التطورات في تسلسل التكنولوجيا مع القدرة علي تسلسل أطول يقرا بدقه عاليه للتغلب علي بعض هذه التحديات. وقد ساعدت تكنولوجيا التسلسل الحالية مع خط أنابيب التحليل metagenomic المتاحة للجمهور مثل R-القائم علي الانقسام خوارزميه دينوسينغ المسببة للانقسام-2 (DADA2) التنميط الميكروبية بدقه عاليه ، كما DADA2 يمكن تعيين تسلسل في جنس ومستويات الأنواع. وصف هنا هو دليل لأداء التنميط البكتيرية باستخدام التضخيم خطوتين من المنطقة V3-V4 من الجينات rRNA 16S ، تليها تحليل باستخدام أدوات التحليل المتاحة بحريه (اي ، DADA2 ، Phyloseq ، و METAGENassist). ويعتقد ان هذا سير العمل بسيطه وكامله سيكون بمثابه أداه ممتازة للباحثين المهتمين في أداء الدراسات التنميط الميكروبيوم.
Introduction
الميكروبات يشير إلى مجموعه من الكائنات الحية الدقيقة (البكتيريا والفيروسات ، الارشييه ، البكتيريا ، والفطريات) الذين يعيشون في بيئة معينه ، ويشير ميكروبيوم إلى الجينوم الجماعي للكائنات المجهرية المقيمة. كما البكتيريا هي واحده من الميكروبات الأكثر وفره في البشر والفئران ، وتركز هذه الدراسة فقط علي التنميط البكتيرية. واستعمرت الأمعاء البشرية من قبل تريليونات من البكتيريا ومئات من سلالات البكتيريا1. الميكروبات المعوية الطبيعية تلعب دورا حيويا في الحفاظ علي حاله صحية في المضيف عن طريق تنظيم وظائف (اي الحفاظ علي حاجز الأمعاء سليمه ، والأيض الغذائي ، والتوازن الطاقة ، وتثبيط الاستعمار من قبل الكائنات المسببة للامراض ، و تنظيم الاستجابات المناعية)2،3،4،5. تم ربط الاضطرابات التركيبية لميكروبات الأمعاء (ديسبيوسيس الأمعاء) بعدد من الامراض البشرية ، بما في ذلك اضطرابات المعدة المعوية6، السمنة7،8، السكتة الدماغية9، السرطان10، مرض السكري8,11, التهاب المفاصل الروماتويدي12, الحساسية13, والامراض المرتبطة بالجهاز العصبي المركزي مثل التصلب المتعدد (MS)14,15 ومرض الزهايمر المرض (AD)8,16. لذلك ، في السنوات الاخيره ، كان هناك اهتمام متزايد في أدوات لتحديد تكوين البكتيريا في مواقع الجسم المختلفة. وينبغي ان يكون أسلوب موثوق بها خصائص مثل كونها عاليه الانتاجيه وسهله الاستخدام ، وجود القدرة علي تصنيف الجراثيم الجرثومية مع ارتفاع القرار ، ويجري منخفضه التكلفة.
التقنيات الميكروبيولوجية القائمة علي الثقافة ليست حساسة بما فيه الكفاية لتحديد وتوصيف الميكروبيوم الأمعاء المعقدة بسبب فشل العديد من بكتيريا الأمعاء تنمو في الثقافة. وقد تغلب ظهور التكنولوجيا القائمة علي التسلسل ، وخاصه التسلسل metagenomic المستندة إلى rrna 16s ، علي بعض من هذه التحديات وتحويل البحوث الميكروبيوم17. وقد ساعد المتقدمة 16S rRNA القائم علي التكنولوجيا التسلسل في إنشاء دور حاسم لميكروبيوم الأمعاء في صحة الإنسان. وقد ساعد مشروع الميكروبات البشرية ، وهو مبادرة المعاهد الوطنية للصحة18، ومشروع MetaHIT (المبادرة الاوروبيه)19 في وضع اطار أساسي للتحليل الميكروبيوم. ساعدت هذه المبادرات علي بدء دراسات متعددة لتحديد دور ميكروبيوم الأمعاء في صحة الإنسان والمرض.
وقد أظهرت عدد من المجموعات ديسبيوسيس الأمعاء في المرضي الذين يعانون من الامراض التهابيه12,14,15,20,21,22. علي الرغم من ان تستخدم علي نطاق واسع لتحديد التصنيف التصنيفي بسبب القدرة علي تعدد الإرسال والتكاليف المنخفضة ، لا توجد بروتوكولات موحده لتنميط التصنيف المستندة إلى rRNA 16S. وهناك قيد آخر هو الدقة المنخفضة للتعيين التصنيفي نظرا لصغر التسلسل يقرا (150 bp أو 250 bp) واستخدام التسلسل الامامي فقط قراءه (R1) بسبب انخفاض جوده التسلسل العكسي يقرا (R2). ومع ذلك ، ساعدت التطورات في تسلسل التكنولوجيا للتغلب علي بعض من هذه التحديات ، مثل القدرة علي تسلسل أطول يقرا باستخدام الاقتران-نهاية القراءة (علي سبيل المثال ، ايلومينا MiSeq 2x300bp).
يمكن للتكنولوجيا التسلسل الحالي تسلسل 600 bp نوعيه جيده يقرا ، والذي يسمح دمج R1 و R2 يقرا. هذه المدمجة أطول R1 و R2 يقرا السماح للتعيينات التصنيفية أفضل ، وخاصه مع الوصول المفتوحة المستندة إلى R المسببة للانقسام الانقسام خوارزميه-2 (DADA2) منصة. يستخدم DADA2 التعيينات المستندة إلى متغير تسلسل الاتساع (ASV) بدلا من التعيينات وحده التصنيف التشغيلية (OTU) استنادا إلى التشابه 97% المستخدمة من قبل QIIME23. وتؤدي مباريات ASV إلى تطابق متسلسل بالبالضبط في قاعده البيانات داخل النواة 1 – 2 ، مما يؤدي إلى التعيين في مستويات الجنس والأنواع. التالي ، فان الجمع بين القراءات الطويلة وذات النوعية الجيدة وأداات التعيين التصنيفية الأفضل (مثل DADA2) قد حول الدراسات الميكروبيوم.
المقدمة هنا هو دليل خطوه بخطوه لأداء التنميط البكتيرية باستخدام التضخيم خطوتين من المنطقة V3-V4 من rRNA 16S وتحليل البيانات باستخدام DADA2 ، Phyloseq ، وأنابيب METAGENassist. لهذه الدراسة ، يتم استخدام مستضد الكريات البيضاء البشرية (هلا) الفئة الثانية الفئران المحورة وراثيا ، وبعض هلا الفئة الثانية الاليل ترتبط مع الاستعداد لامراض المناعة الذاتية مثل MS20،24،25. ومع ذلك ، فان اهميه الجينات من الدرجة الثانية في تنظيم تكوين الجراثيم المعوية غير معروفه. هو افترضت ان ال [هلا] صنف [ايي] جزيء سياثر مجتمعه جراثيم جرثوميه ب ينتقي لجراثيم خاصه. مركب التوافق الرئيسية المدرج (mhc) الفئة الثانية الفئران الضربة القاضية (اي كو) أو الفئران التعبير عن جزيئات DQ8 الإنسان (DQ8)24,25,26 واستخدمت من أجل فهم اهميه الجزيئات هلا من الدرجة الثانية في تشكيل المجتمع الميكروبية الأمعاء. ويعتقد ان هذا العمل الكامل والمبسط مع تحليل البيانات المستندة إلى R سيكون بمثابه أداه ممتازة للباحثين المهتمين في أداء الدراسات التنميط الميكروبيوم.
جيل الفئران التي تفتقر الداخلية murine MHC فئة الجينات الثانية (AE. كو) و AE-/-. DQA1 * 0103 ، DQB1 * 0302 (هلا-DQ8) تم وصف الفئران المحورة وراثيا مع خلفيه C57BL/6J سابقا26. يتم جمع عينات من البراز من الفئران من كلا الجنسين (8 – 12 أسبوعا من العمر). وقد ولدت الفئران في السابق والحفاظ عليها في منشاه الحيوانية جامعه أيوا وفقا للصحة القومية والمبادئ التوجيهية المؤسسية. استراتيجيات التحكم في التلوث مثل الفطام من الفئران داخل مجلس الوزراء تدفق الرقائقي ، وتغيير القفازات بين سلالات مختلفه من الفئران ، والصيانة السليمة للفئران خطوات حاسمه لتحديد الملامح من ميكروبيوم الأمعاء.
ينصح بشده باستخدام معدات الحماية الشخصية المناسبة خلال الاجراء بأكمله. يجب تضمين عناصر التحكم السلبية المناسبة عند تنفيذ عزل الحمض النووي ، PCR1 و PCR2 التضخيم ، وخطوات التسلسل. ينصح باستخدام المعقمة ، خاليه من DNase ، RNase خاليه ، واللوازم الخالية من مولد حر. وينبغي استخدام pipettor المعين للعمل الميكروبيوم ونصائح ماصه المصفاة في جميع انحاء البروتوكول. يتكون تحليل الجراثيم المجهرية من سبع خطوات: 1) جمع العينات ومعالجتها بالبراز ؛ 2) استخراج الحمض النووي ؛ 3) التضخيم الجينات rRNA 16S ؛ 4) بناء مكتبه الحمض النووي باستخدام PCR المفهرسة ؛ 5) تنظيف والتقدير الكمي لل PCR المفهرسة (مكتبه) ؛ 6) التسلسل MiSeq ؛ و 7) معالجه البيانات وتحليل التسلسل. ويرد في الشكل 1رسم تخطيطي لجميع خطوات البروتوكول.
Protocol
Representative Results
Discussion
البروتوكول الموصوف بسيط ، مع خطوات سهله لتنفيذ التنميط الميكروبيوم باستخدام 16s rrna metagenomic التسلسل من عدد كبير من الحيوية التي تهم. الجيل التالي من التسلسل قد حولت دراسات الإيكولوجيا الميكروبية ، وخاصه في نماذج الامراض البشرية وما قبل السريرية31،32. والميزة ال…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ويعترف المؤلفون بالتمويل من المعاهد القومية للصحة (1R01AI137075-01) ، ومنحه مبادرة كارفر ترست للبحوث الطبية ، ومركز بحوث علوم الصحة البيئية في جامعه أيوا ، نيهس/المعاهد القومية للصحة (P30 ES005605).
Materials
| 1.5 ml Natural Microcentriguge Tube | USA, Scientific | 1615-5500 | Fecal collection |
| 3M hand applicator squeegee PA1-G | 3M, MN, US | 7100038651 | Squeeger for proper sealing of PCR Plate |
| Agencourt AMPure XP | Beckman Coulter, IN, USA | A63880 | PCR Purification, NGS Clean-up, PCR clean-up |
| Agilent DNA 1000 REAGENT | Agilent Technologies, CA, USA | 5067-1504 | DNA quantification and quality control |
| Bioanalyzer DNA 1000 chip | Agilent Technologies, CA, USA | 5067-1504 | DNA quantification and quality control |
| Index Adopter Replacement Caps | Illumina, Inc., CA, USA | 15026762 | New cap for Index 1 and 2 adopter primer |
| DNeasy PowerLyzer PowerSoil Kit | MoBio now part of QIAGEN, Valencia, CA, USA | 12855-100 | DNA isolation |
| KAPA HiFi HotStart ReadyMiX (2X) | Kapa Biosystem, MA, USA | KK2602 | PCR ready mix for Amplicon PCR1 and Indexed PCR2 |
| Lewis Divider Boxes | Lewis Bins, WI, US | ND03080 | Fecal collection |
| Magnetic stand | New England BioLabs, MA, USA | S1509S | For PCR clean-up |
| MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate | Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific, CA, USA | 4346906 | PCR Plate |
| MicroAmp Optical Adhesive Film | Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific, CA, USA | 4311971 | PCR Plate Sealer |
| Microfuge 20 Centrifuge | Beckman Coulter, IN, USA | B30154 | Centrifuge used for DNA isolation |
| MiSeq Reagent Kit (600 cycles)v.3 | Illumina, Inc., CA, USA | MS-102-3003 | For MiSeq Sequencing |
| Nextera XT DNA Library Preparation Kit | Illumina, Inc., CA, USA | FC-131-1001 | 16S rRNA DNA Library Preparation |
| Reagent Reservoirs Multichannel Trays | ASI, FL,USA | RS71-1 | For Pooling of PCR2 Product |
| Plate Cetrifuge | Thermo Fisher Scientific, CA, USA | 75004393 | For PCR reagent mixing and removing air bubble from Plate |
| PhiX Control | Illumina, Inc., CA, USA | FC-110-3001 | For MiSeq Sequencing control |
| Microbiome DNA Purification Kit | Thermo Fisher Scientific, CA, USA | A29789 | For purification of PCR1 product |
| PowerLyzer 24 Homogenizer | Omni International, GA, USA | 19-001 | Bead beater for DNA Isolation |
| Qubit dsDNA HS (High Sensitivity) assay kit | Thermo Fisher Scientific, CA, USA | Q32854 | DNA quantification |
| TruSeq Index Plate Fixture | Illumina, Inc., CA, USA | FC-130-1005 | For Arranging of the index primers |
| Vertical Dividers (large) | Lewis Bins, WI, US | DV-2280 | Fecal collection |
| Vertical Dividers (small) | Lewis Bins, WI, US | DV-1780 | Fecal collection |
References
- Lynch, S. V., Pedersen, O. The Human Intestinal Microbiome in Health and Disease. New England Journal of Medicine. 375 (24), 2369-2379 (2016).
- Blacher, E., Levy, M., Tatirovsky, E., Elinav, E. Microbiome-Modulated Metabolites at the Interface of Host Immunity. Journal of Immunology. 198 (2), 572-580 (2017).
- Jarchum, I., Pamer, E. G. Regulation of innate and adaptive immunity by the commensal microbiota. Current Opinion in Immunology. 23 (3), 353-360 (2011).
- Rescigno, M. The intestinal epithelial barrier in the control of homeostasis and immunity. Trends in Immunology. 32 (6), 256-264 (2011).
- Zhang, K., Hornef, M. W., Dupont, A. The intestinal epithelium as guardian of gut barrier integrity. Cell Microbiology. 17 (11), 1561-1569 (2015).
- Ghoshal, U. C., Park, H., Gwee, K. A. Bugs and irritable bowel syndrome: The good, the bad and the ugly. Journal of Gastroenterology and Hepatology. 25 (2), 244-251 (2010).
- Ley, R. E., Turnbaugh, P. J., Klein, S., Gordon, J. I. Microbial ecology: human gut microbes associated with obesity. Nature. 444 (7122), 1022-1023 (2006).
- Naseer, M. I., et al. Role of gut microbiota in obesity, type 2 diabetes and Alzheimer’s disease. CNS & Neurological Disorders – Drug Targets. 13 (2), 305-311 (2014).
- Yin, J., et al. Dysbiosis of Gut Microbiota With Reduced Trimethylamine-N-Oxide Level in Patients With Large-Artery Atherosclerotic Stroke or Transient Ischemic Attack. Journal of American Heart Association. 4 (11), (2015).
- Azcarate-Peril, M. A., Sikes, M., Bruno-Barcena, J. M. The intestinal microbiota, gastrointestinal environment and colorectal cancer: a putative role for probiotics in prevention of colorectal cancer. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 301 (3), 401-424 (2011).
- Su, M., et al. Diversified gut microbiota in newborns of mothers with gestational diabetes mellitus. PLoS ONE. 13 (10), 0205695 (2018).
- Horta-Baas, G., et al. Intestinal Dysbiosis and Rheumatoid Arthritis: A Link between Gut Microbiota and the Pathogenesis of Rheumatoid Arthritis. Journal of Immunological Research. , 4835189 (2017).
- Panzer, A. R., Lynch, S. V. Influence and effect of the human microbiome in allergy and asthma. Current Opinion in Rheumatology. 27 (4), 373-380 (2015).
- Chen, J., et al. Multiple sclerosis patients have a distinct gut microbiota compared to healthy controls. Science Reports. 6, 28484 (2016).
- Tremlett, H., et al. Gut microbiota composition and relapse risk in pediatric MS: A pilot study. Journal of Neurological Science. 363, 153-157 (2016).
- Pistollato, F., et al. Role of gut microbiota and nutrients in amyloid formation and pathogenesis of Alzheimer disease. Nutritional Reviews. 74 (10), 624-634 (2016).
- Caporaso, J. G., et al. Global patterns of 16S rRNA diversity at a depth of millions of sequences per sample. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 108, 4516-4522 (2011).
- Turnbaugh, P. J., et al. The human microbiome project. Nature. 449 (7164), 804-810 (2007).
- Dusko Ehrlich, S. Meta, H.I.T.c. Metagenomics of the intestinal microbiota: potential applications. Gastroenterologie Clinique et Biologique. 34, 23-28 (2010).
- Jangi, S., et al. Alterations of the human gut microbiome in multiple sclerosis. Nature Communications. 7, 12015 (2016).
- Miyake, S., et al. Dysbiosis in the Gut Microbiota of Patients with Multiple Sclerosis, with a Striking Depletion of Species Belonging to Clostridia XIVa and IV Clusters. PLoS ONE. 10 (9), 0137429 (2015).
- Shahi, S. K., Freedman, S. N., Mangalam, A. K. Gut microbiome in multiple sclerosis: The players involved and the roles they play. Gut Microbes. 8 (6), 607-615 (2017).
- Callahan, B. J., et al. DADA2: High-resolution sample inference from Illumina amplicon data. Nature Methods. 13 (7), 581-583 (2016).
- Das, P., et al. Complementation between specific HLA-DR and HLA-DQ genes in transgenic mice determines susceptibility to experimental autoimmune encephalomyelitis. Human Immunology. 61 (3), 279-289 (2000).
- Mangalam, A. K., Rajagopalan, G., Taneja, V., David, C. S. HLA class II transgenic mice mimic human inflammatory diseases. Advances in Immunology. 97, 65-147 (2008).
- Mangalam, A., et al. HLA-DQ8 (DQB1*0302)-restricted Th17 cells exacerbate experimental autoimmune encephalomyelitis in HLA-DR3-transgenic mice. Journal of Immunology. 182 (8), 5131-5139 (2009).
- Kiernan, M. G., et al. The Human Mesenteric Lymph Node Microbiome Differentiates Between Crohn’s Disease and Ulcerative Colitis. Journal of Crohn’s & Colitis. 13 (1), 58-66 (2019).
- McMurdie, P. J., Holmes, S. phyloseq: an R package for reproducible interactive analysis and graphics of microbiome census data. PLoS ONE. 8 (4), 61217 (2013).
- Arndt, D., et al. METAGENassist: a comprehensive web server for comparative metagenomics. Nucleic Acids Research. 40, 88-95 (2012).
- Hugerth, L. W., Andersson, A. F. Analysing Microbial Community Composition through Amplicon Sequencing: From Sampling to Hypothesis Testing. Frontiers in Microbiology. 8, 1561 (2017).
- Srinivasan, R., et al. Use of 16S rRNA gene for identification of a broad range of clinically relevant bacterial pathogens. PLoS ONE. 10 (2), 0117617 (2015).
- Didelot, X., Bowden, R., Wilson, D. J., Peto, T. E. A., Crook, D. W. Transforming clinical microbiology with bacterial genome sequencing. Nature Reviews Genetics. 13 (9), 601-612 (2012).
- Buermans, H. P., den Dunnen, J. T. Next generation sequencing technology: Advances and applications. Biochimica et Biophysica Acta. 1842 (10), 1932-1941 (2014).
- Cai, L., Ye, L., Tong, A. H., Lok, S., Zhang, T. Biased diversity metrics revealed by bacterial 16S pyrotags derived from different primer sets. PLoS ONE. 8 (1), 53649 (2013).
- Kuczynski, J., et al. Experimental and analytical tools for studying the human microbiome. Nature Reviews Genetics. 13 (1), 47-58 (2011).
- Mangalam, A., et al. Human Gut-Derived Commensal Bacteria Suppress CNS Inflammatory and Demyelinating Disease. Cell Reports. 20 (6), 1269-1277 (2017).
- Shahi, S. K., et al. Prevotella histicola, A Human Gut Commensal, Is as Potent as COPAXONE(R) in an Animal Model of Multiple Sclerosis. Frontiers in Immunology. 10, 462 (2019).
- Bliss, D. Z., et al. Comparison of subjective classification of stool consistency and stool water content. Journal of Wound Ostomy & Continence Nursing. 26 (3), 137-141 (1999).
- Kim, D., et al. Optimizing methods and dodging pitfalls in microbiome research. Microbiome. 5 (1), 52 (2017).
- Sinha, R., et al. Collecting Fecal Samples for Microbiome Analyses in Epidemiology Studies. Cancer Epidemiology, Biomarkers & Prevention. 25 (2), 407-416 (2016).
- Salonen, A., et al. Comparative analysis of fecal DNA extraction methods with phylogenetic microarray: effective recovery of bacterial and archaeal DNA using mechanical cell lysis. Journal of Microbiological Methods. 81 (2), 127-134 (2010).
- Santiago, A., et al. Processing faecal samples: a step forward for standards in microbial community analysis. BMC Microbiology. 14, 112 (2014).
- Glassing, A., Dowd, S. E., Galandiuk, S., Davis, B., Chiodini, R. J. Inherent bacterial DNA contamination of extraction and sequencing reagents may affect interpretation of microbiota in low bacterial biomass samples. Gut Pathogens. 8, 24 (2016).
- Salter, S. J., et al. Reagent and laboratory contamination can critically impact sequence-based microbiome analyses. BMC Biology. 12, 87 (2014).
- Weiss, S., et al. Tracking down the sources of experimental contamination in microbiome studies. Genome Biology. 15 (12), 564 (2014).
- Lozupone, C., Lladser, M. E., Knights, D., Stombaugh, J., Knight, R. UniFrac: an effective distance metric for microbial community comparison. ISME Journal. 5 (2), 169-172 (2011).
- Schloss, P. D. Evaluating different approaches that test whether microbial communities have the same structure. ISME Journal. 2 (3), 265-275 (2008).
- Xia, Y., Sun, J. Hypothesis Testing and Statistical Analysis of Microbiome. Genes & Diseases. 4 (3), 138-148 (2017).
- Malla, M. A., et al. Exploring the Human Microbiome: The Potential Future Role of Next-Generation Sequencing in Disease Diagnosis and Treatment. Frontiers in Immunology. 9, 2868 (2018).
