Microbiota-analyse met behulp van twee-stap PCR en de volgende generatie 16S rRNA Gensequencing
Summary
Hier beschreven is een vereenvoudigde standaard werkings procedure voor microbiome profilering met behulp van 16S rRNA metagenomic sequencing en analyse met behulp van vrij beschikbare instrumenten. Dit protocol zal onderzoekers die nieuw zijn in het microbiome veld en degenen die updates vereisen over methoden om bacteriële profilering bij een hogere resolutie te bereiken helpen.
Abstract
De menselijke darm wordt gekoloniseerd door triljoenen bacteriën die fysiologische functies ondersteunen zoals voedsel metabolisme, energie oogsten, en regulering van het immuunsysteem. Perturbatie van de gezonde gut microbiome is gesuggereerd om een rol te spelen bij de ontwikkeling van ontstekingsziekten, met inbegrip van multiple sclerose (MS). Milieu-en genetische factoren kunnen de samenstelling van het microbiome beïnvloeden; Daarom is de identificatie van microbiële gemeenschappen in verband met een fenotype ziekte de eerste stap geworden naar het definiëren van de rol van het microbiome in gezondheid en ziekte. Gebruik van 16S rRNA metagenomic sequencing voor profilering bacteriële Gemeenschap heeft geholpen bij het bevorderen van microbiome onderzoek. Ondanks het brede gebruik is er geen uniform protocol voor 16S rRNA-gebaseerde taxonomische profilerings analyse. Een andere beperking is de lage resolutie van taxonomische toewijzing als gevolg van technische moeilijkheden zoals kleinere sequentiëren, evenals het gebruik van alleen voorwaartse (R1) leesbewerkingen in de uiteindelijke analyse als gevolg van lage kwaliteit van omgekeerde (R2) leesbewerkingen. Er is behoefte aan een vereenvoudigde methode met een hoge resolutie om de bacterie diversiteit in een bepaald biospecimen te karakteriseren. Verbeteringen in sequentiëren van technologie met de mogelijkheid om langere leesbewerkingen bij hoge resolutie te sequenties hebben geholpen om een aantal van deze uitdagingen te overwinnen. Huidige sequencing technologie in combinatie met een algemeen beschikbare metagenomic analyse pijpleiding, zoals R-gebaseerde Divisive Amplicon die het algoritme-2 (DADA2) heeft geholpen om microbiële profilering bij hoge resolutie te voorkomen, omdat DADA2 sequentie kan toewijzen aan het genus en soorten. Hier beschreven is een gids voor het uitvoeren van bacteriële profilering met behulp van tweestapsversterking van de v3-v4-regio van het 16S rRNA-gen, gevolgd door analyse met behulp van vrij beschikbare analysetools (d.w.z. DADA2, Phyloseq en METAGENassist). Er wordt aangenomen dat deze eenvoudige en volledige workflow zal dienen als een uitstekend hulpmiddel voor onderzoekers die geïnteresseerd zijn in het uitvoeren van microbiome profilering studies.
Introduction
Microbiota verwijst naar een verzameling van micro-organismen (bacteriën, virussen, Archaea, bacteriofagen en schimmels) die in een bepaalde omgeving leven, en de microbiome verwijst naar het collectieve genoom van ingezeten micro-organismen. Aangezien bacteriën een van de meest voorkomende microben bij mensen en muizen zijn, is deze studie alleen gericht op bacteriële profilering. De menselijke darm wordt gekoloniseerd door triljoenen bacteriën en honderden bacteriële stammen1. De normale gut microbiota speelt een vitale rol bij het handhaven van een gezonde staat in de gastheer door het reguleren van functies (dat wil zeggen, onderhoud van een intacte intestinale barrière, voedsel metabolisme, energie homeostase, remming van de kolonisatie door pathogene organismen, en regulering van de immuunresponsen)2,3,4,5. Compositorische perturbaties van de darm microbiota (gut dysbiosis) zijn gekoppeld aan een aantal menselijke ziekten, met inbegrip van gastro-intestinale stoornissen6, obesitas7,8, beroerte9, Cancer10, diabetes8,11, reumatoïde artritis12, allergieën13, en het centrale zenuwstelsel-gerelateerde ziekten zoals multiple sclerose (MS)14,15 en de ziekte van Alzheimer ziekte (AD)8,16. Daarom, in de afgelopen jaren, is er groeiende belangstelling voor instrumenten voor het identificeren van bacteriële samenstelling op verschillende lichaam sites. Een betrouwbare methode moet kenmerken hebben zoals hoge doorvoer en eenvoudig te gebruiken, met de mogelijkheid om bacteriële microbiota met hoge resolutie te classificeren, en lage kosten.
Op cultuur gebaseerde microbiologische technieken zijn niet gevoelig genoeg om het complexe darmmicrobioom te identificeren en karakteriseren als gevolg van het falen van verschillende darmbacteriën om in cultuur te groeien. De opkomst van de sequencing-gebaseerde technologie, met name 16S rRNA gebaseerde metagenomische sequencing, heeft een aantal van deze uitdagingen overwonnen en getransformeerd microbiome onderzoek17. Geavanceerde 16S rRNA-gebaseerde sequentie technologie heeft geholpen bij het vaststellen van een cruciale rol voor het microbioom van de darmen in de menselijke gezondheid. Het humane Microbiome project, een National Institutes of Health Initiative18, en het metahit project (een Europees initiatief)19 hebben beiden geholpen bij het opzetten van een basiskader voor Microbiome analyse. Deze initiatieven hielpen een kick-start van meerdere studies om de rol van het microbioom van de darmen in de menselijke gezondheid en ziekte te bepalen.
Een aantal groepen hebben aangetoond gut dysbiosis bij patiënten met ontstekingsziekten12,14,15,20,21,22. Ondanks dat het op grote schaal wordt gebruikt voor taxonomische profilering vanwege het vermogen tot multiplex en lage kosten, zijn er geen uniforme protocollen voor 16S rRNA-gebaseerde taxonomische profilering. Een andere beperking is de lage resolutie van taxonomische toewijzing als gevolg van kleinere sequentiëren leesbewerkingen (150 BP of 250 BP) en het gebruik van alleen voorwaartse sequentiëring lezen (R1) als gevolg van lage kwaliteit omgekeerde sequencing leest (R2). Echter, vooruitgang in de sequencing technologie hebben geholpen om een aantal van deze uitdagingen te overwinnen, zoals de mogelijkheid om sequenties langere leesbewerkingen met behulp van gepaarde eind leesbewerkingen (bijvoorbeeld, Illumina MiSeq 2x300bp).
De huidige sequencing technologie kan sequentie 600 BP goede kwaliteit leest, die het mogelijk maakt samenvoeging van R1 en R2 leest. Deze samengevoegde langere R1 en R2 leesbewerkingen toestaan betere taxonomische toewijzingen, met name met open-toegang op basis van R gebaseerde Divisive Amplicon te geven algoritme-2 (DADA2) platform. DADA2 maakt gebruik van ampliconlengte voor temp sequence variant (ASV)-gebaseerde opdrachten in plaats van de operationele taxonomische eenheid (Otu) toewijzingen op basis van 97% gelijkenis gebruikt door qiime23. ASV Matches resulteren in een exacte sequentie match in de database binnen 1 – 2 nucleotiden, wat leidt tot toewijzing op genus-en soorten niveau. Dus, de combinatie van langere, goede kwaliteit gepaarde Lees-en betere taxonomische toewijzings tools (zoals DADA2) hebben microbiome studies getransformeerd.
Hier is een stapsgewijze handleiding voor het uitvoeren van bacteriële profilering met behulp van twee-stap versterking van de v3-v4 regio van 16S rRNA en data-analyse met behulp van DADA2, Phyloseq, en METAGENassist pijplijnen. Voor deze studie worden humane leukocytenantigeen (HLA) klasse II-transgene muizen gebruikt, aangezien bepaalde HLA klasse II-allelen zijn gekoppeld aan een aanleg voor auto-immuunziekten zoals MS20,24,25. Echter, het belang van HLA klasse II genen bij het reguleren van de samenstelling van gut microbiota is onbekend. Het is veronderstelde dat de HLA klasse II molecuul zal beïnvloeden gut microbiële Gemeenschap door te selecteren voor specifieke bacteriën. Grote histocompatibility complex (MHC) klasse II knock-outmuizen (AE Ko) of muizen die humane HLA-DQ8 moleculen (HLA-DQ8)24,25,26 uitdrukken, werden gebruikt om het belang van HLA klasse II moleculen te begrijpen in het vorm geven van de darm microbiële Gemeenschap. Er wordt aangenomen dat deze volledige en vereenvoudigde workflow met R-gebaseerde data-analyse zal dienen als een uitstekend hulpmiddel voor onderzoekers die geïnteresseerd zijn in het uitvoeren van microbiome profilering studies.
De generatie van muizen ontbreekt endogene Murine MHC klasse II genen (AE KO) en AE-/-. HLA-DQA1 * 0103, DQB1 * 0302 (HLA-DQ8) transgene muizen met een C57BL/6J achtergrond is eerder beschreven26. Fecale monsters worden verzameld van muizen van beide geslachten (8 – 12 weken oud). Muizen werden eerder gefokt en onderhouden in de Universiteit van Iowa Animal Facility volgens de NIH en institutionele richtlijnen. Strategieën voor verontreinigingsbeheersing zoals het spenen van de muizen in een laminaire stromings kast, het verwisselen van handschoenen tussen verschillende stammen van muizen en het correct onderhoud van muizen zijn cruciale stappen voor profilering van het microbioom van de darmen.
Goede persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM) worden ten zeerste aanbevolen tijdens de gehele procedure. Geschikte negatieve controles moeten worden opgenomen bij het uitvoeren van DNA-isolatie, PCR1 en PCR2 versterking en sequentiëren stappen. Het gebruik van steriele, DNase-vrije, RNase-vrije en pyrogene-vrije voorraden wordt aanbevolen. Aangewezen pipet voor microbioom werk en gefilterde pipetpunten moeten in het hele protocol worden gebruikt. Microbiota-analyse bestaat uit zeven stappen: 1) fecale monsterverzameling en-verwerking; 2) extractie van DNA; 3) 16S rRNA genamplificatie; 4) DNA-bibliotheek constructie met behulp van geïndexeerde PCR; 5) opschonen en kwantificering van de geïndexeerde PCR (Library); 6) MiSeq-sequencing; en 7) gegevensverwerking en sequentieanalyse. Een schematisch diagram van alle protocol stappen wordt weergegeven in Figuur 1.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het beschreven protocol is eenvoudig, met gemakkelijk te volgen stappen voor het uitvoeren van microbiome profilering met behulp van 16S rRNA metagenomic sequencing van een groot aantal biospecimens van belang. De volgende generatie sequencing heeft microbiële ecologie studies getransformeerd, vooral in humane en preklinische ziekte modellen31,32. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is de mogelijkheid om complexe microbiële composities (culturable en n…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs erkennen de financiering van de NIAID/NIH (1R01AI137075-01), de Carver Trust Medical Research Initiative Grant, en het University of Iowa Environmental Health Sciences Research Center, NIEHS/NIH (P30 ES005605).
Materials
| 1.5 ml Natural Microcentriguge Tube | USA, Scientific | 1615-5500 | Fecal collection |
| 3M hand applicator squeegee PA1-G | 3M, MN, US | 7100038651 | Squeeger for proper sealing of PCR Plate |
| Agencourt AMPure XP | Beckman Coulter, IN, USA | A63880 | PCR Purification, NGS Clean-up, PCR clean-up |
| Agilent DNA 1000 REAGENT | Agilent Technologies, CA, USA | 5067-1504 | DNA quantification and quality control |
| Bioanalyzer DNA 1000 chip | Agilent Technologies, CA, USA | 5067-1504 | DNA quantification and quality control |
| Index Adopter Replacement Caps | Illumina, Inc., CA, USA | 15026762 | New cap for Index 1 and 2 adopter primer |
| DNeasy PowerLyzer PowerSoil Kit | MoBio now part of QIAGEN, Valencia, CA, USA | 12855-100 | DNA isolation |
| KAPA HiFi HotStart ReadyMiX (2X) | Kapa Biosystem, MA, USA | KK2602 | PCR ready mix for Amplicon PCR1 and Indexed PCR2 |
| Lewis Divider Boxes | Lewis Bins, WI, US | ND03080 | Fecal collection |
| Magnetic stand | New England BioLabs, MA, USA | S1509S | For PCR clean-up |
| MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate | Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific, CA, USA | 4346906 | PCR Plate |
| MicroAmp Optical Adhesive Film | Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific, CA, USA | 4311971 | PCR Plate Sealer |
| Microfuge 20 Centrifuge | Beckman Coulter, IN, USA | B30154 | Centrifuge used for DNA isolation |
| MiSeq Reagent Kit (600 cycles)v.3 | Illumina, Inc., CA, USA | MS-102-3003 | For MiSeq Sequencing |
| Nextera XT DNA Library Preparation Kit | Illumina, Inc., CA, USA | FC-131-1001 | 16S rRNA DNA Library Preparation |
| Reagent Reservoirs Multichannel Trays | ASI, FL,USA | RS71-1 | For Pooling of PCR2 Product |
| Plate Cetrifuge | Thermo Fisher Scientific, CA, USA | 75004393 | For PCR reagent mixing and removing air bubble from Plate |
| PhiX Control | Illumina, Inc., CA, USA | FC-110-3001 | For MiSeq Sequencing control |
| Microbiome DNA Purification Kit | Thermo Fisher Scientific, CA, USA | A29789 | For purification of PCR1 product |
| PowerLyzer 24 Homogenizer | Omni International, GA, USA | 19-001 | Bead beater for DNA Isolation |
| Qubit dsDNA HS (High Sensitivity) assay kit | Thermo Fisher Scientific, CA, USA | Q32854 | DNA quantification |
| TruSeq Index Plate Fixture | Illumina, Inc., CA, USA | FC-130-1005 | For Arranging of the index primers |
| Vertical Dividers (large) | Lewis Bins, WI, US | DV-2280 | Fecal collection |
| Vertical Dividers (small) | Lewis Bins, WI, US | DV-1780 | Fecal collection |
References
- Lynch, S. V., Pedersen, O. The Human Intestinal Microbiome in Health and Disease. New England Journal of Medicine. 375 (24), 2369-2379 (2016).
- Blacher, E., Levy, M., Tatirovsky, E., Elinav, E. Microbiome-Modulated Metabolites at the Interface of Host Immunity. Journal of Immunology. 198 (2), 572-580 (2017).
- Jarchum, I., Pamer, E. G. Regulation of innate and adaptive immunity by the commensal microbiota. Current Opinion in Immunology. 23 (3), 353-360 (2011).
- Rescigno, M. The intestinal epithelial barrier in the control of homeostasis and immunity. Trends in Immunology. 32 (6), 256-264 (2011).
- Zhang, K., Hornef, M. W., Dupont, A. The intestinal epithelium as guardian of gut barrier integrity. Cell Microbiology. 17 (11), 1561-1569 (2015).
- Ghoshal, U. C., Park, H., Gwee, K. A. Bugs and irritable bowel syndrome: The good, the bad and the ugly. Journal of Gastroenterology and Hepatology. 25 (2), 244-251 (2010).
- Ley, R. E., Turnbaugh, P. J., Klein, S., Gordon, J. I. Microbial ecology: human gut microbes associated with obesity. Nature. 444 (7122), 1022-1023 (2006).
- Naseer, M. I., et al. Role of gut microbiota in obesity, type 2 diabetes and Alzheimer’s disease. CNS & Neurological Disorders – Drug Targets. 13 (2), 305-311 (2014).
- Yin, J., et al. Dysbiosis of Gut Microbiota With Reduced Trimethylamine-N-Oxide Level in Patients With Large-Artery Atherosclerotic Stroke or Transient Ischemic Attack. Journal of American Heart Association. 4 (11), (2015).
- Azcarate-Peril, M. A., Sikes, M., Bruno-Barcena, J. M. The intestinal microbiota, gastrointestinal environment and colorectal cancer: a putative role for probiotics in prevention of colorectal cancer. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 301 (3), 401-424 (2011).
- Su, M., et al. Diversified gut microbiota in newborns of mothers with gestational diabetes mellitus. PLoS ONE. 13 (10), 0205695 (2018).
- Horta-Baas, G., et al. Intestinal Dysbiosis and Rheumatoid Arthritis: A Link between Gut Microbiota and the Pathogenesis of Rheumatoid Arthritis. Journal of Immunological Research. , 4835189 (2017).
- Panzer, A. R., Lynch, S. V. Influence and effect of the human microbiome in allergy and asthma. Current Opinion in Rheumatology. 27 (4), 373-380 (2015).
- Chen, J., et al. Multiple sclerosis patients have a distinct gut microbiota compared to healthy controls. Science Reports. 6, 28484 (2016).
- Tremlett, H., et al. Gut microbiota composition and relapse risk in pediatric MS: A pilot study. Journal of Neurological Science. 363, 153-157 (2016).
- Pistollato, F., et al. Role of gut microbiota and nutrients in amyloid formation and pathogenesis of Alzheimer disease. Nutritional Reviews. 74 (10), 624-634 (2016).
- Caporaso, J. G., et al. Global patterns of 16S rRNA diversity at a depth of millions of sequences per sample. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 108, 4516-4522 (2011).
- Turnbaugh, P. J., et al. The human microbiome project. Nature. 449 (7164), 804-810 (2007).
- Dusko Ehrlich, S. Meta, H.I.T.c. Metagenomics of the intestinal microbiota: potential applications. Gastroenterologie Clinique et Biologique. 34, 23-28 (2010).
- Jangi, S., et al. Alterations of the human gut microbiome in multiple sclerosis. Nature Communications. 7, 12015 (2016).
- Miyake, S., et al. Dysbiosis in the Gut Microbiota of Patients with Multiple Sclerosis, with a Striking Depletion of Species Belonging to Clostridia XIVa and IV Clusters. PLoS ONE. 10 (9), 0137429 (2015).
- Shahi, S. K., Freedman, S. N., Mangalam, A. K. Gut microbiome in multiple sclerosis: The players involved and the roles they play. Gut Microbes. 8 (6), 607-615 (2017).
- Callahan, B. J., et al. DADA2: High-resolution sample inference from Illumina amplicon data. Nature Methods. 13 (7), 581-583 (2016).
- Das, P., et al. Complementation between specific HLA-DR and HLA-DQ genes in transgenic mice determines susceptibility to experimental autoimmune encephalomyelitis. Human Immunology. 61 (3), 279-289 (2000).
- Mangalam, A. K., Rajagopalan, G., Taneja, V., David, C. S. HLA class II transgenic mice mimic human inflammatory diseases. Advances in Immunology. 97, 65-147 (2008).
- Mangalam, A., et al. HLA-DQ8 (DQB1*0302)-restricted Th17 cells exacerbate experimental autoimmune encephalomyelitis in HLA-DR3-transgenic mice. Journal of Immunology. 182 (8), 5131-5139 (2009).
- Kiernan, M. G., et al. The Human Mesenteric Lymph Node Microbiome Differentiates Between Crohn’s Disease and Ulcerative Colitis. Journal of Crohn’s & Colitis. 13 (1), 58-66 (2019).
- McMurdie, P. J., Holmes, S. phyloseq: an R package for reproducible interactive analysis and graphics of microbiome census data. PLoS ONE. 8 (4), 61217 (2013).
- Arndt, D., et al. METAGENassist: a comprehensive web server for comparative metagenomics. Nucleic Acids Research. 40, 88-95 (2012).
- Hugerth, L. W., Andersson, A. F. Analysing Microbial Community Composition through Amplicon Sequencing: From Sampling to Hypothesis Testing. Frontiers in Microbiology. 8, 1561 (2017).
- Srinivasan, R., et al. Use of 16S rRNA gene for identification of a broad range of clinically relevant bacterial pathogens. PLoS ONE. 10 (2), 0117617 (2015).
- Didelot, X., Bowden, R., Wilson, D. J., Peto, T. E. A., Crook, D. W. Transforming clinical microbiology with bacterial genome sequencing. Nature Reviews Genetics. 13 (9), 601-612 (2012).
- Buermans, H. P., den Dunnen, J. T. Next generation sequencing technology: Advances and applications. Biochimica et Biophysica Acta. 1842 (10), 1932-1941 (2014).
- Cai, L., Ye, L., Tong, A. H., Lok, S., Zhang, T. Biased diversity metrics revealed by bacterial 16S pyrotags derived from different primer sets. PLoS ONE. 8 (1), 53649 (2013).
- Kuczynski, J., et al. Experimental and analytical tools for studying the human microbiome. Nature Reviews Genetics. 13 (1), 47-58 (2011).
- Mangalam, A., et al. Human Gut-Derived Commensal Bacteria Suppress CNS Inflammatory and Demyelinating Disease. Cell Reports. 20 (6), 1269-1277 (2017).
- Shahi, S. K., et al. Prevotella histicola, A Human Gut Commensal, Is as Potent as COPAXONE(R) in an Animal Model of Multiple Sclerosis. Frontiers in Immunology. 10, 462 (2019).
- Bliss, D. Z., et al. Comparison of subjective classification of stool consistency and stool water content. Journal of Wound Ostomy & Continence Nursing. 26 (3), 137-141 (1999).
- Kim, D., et al. Optimizing methods and dodging pitfalls in microbiome research. Microbiome. 5 (1), 52 (2017).
- Sinha, R., et al. Collecting Fecal Samples for Microbiome Analyses in Epidemiology Studies. Cancer Epidemiology, Biomarkers & Prevention. 25 (2), 407-416 (2016).
- Salonen, A., et al. Comparative analysis of fecal DNA extraction methods with phylogenetic microarray: effective recovery of bacterial and archaeal DNA using mechanical cell lysis. Journal of Microbiological Methods. 81 (2), 127-134 (2010).
- Santiago, A., et al. Processing faecal samples: a step forward for standards in microbial community analysis. BMC Microbiology. 14, 112 (2014).
- Glassing, A., Dowd, S. E., Galandiuk, S., Davis, B., Chiodini, R. J. Inherent bacterial DNA contamination of extraction and sequencing reagents may affect interpretation of microbiota in low bacterial biomass samples. Gut Pathogens. 8, 24 (2016).
- Salter, S. J., et al. Reagent and laboratory contamination can critically impact sequence-based microbiome analyses. BMC Biology. 12, 87 (2014).
- Weiss, S., et al. Tracking down the sources of experimental contamination in microbiome studies. Genome Biology. 15 (12), 564 (2014).
- Lozupone, C., Lladser, M. E., Knights, D., Stombaugh, J., Knight, R. UniFrac: an effective distance metric for microbial community comparison. ISME Journal. 5 (2), 169-172 (2011).
- Schloss, P. D. Evaluating different approaches that test whether microbial communities have the same structure. ISME Journal. 2 (3), 265-275 (2008).
- Xia, Y., Sun, J. Hypothesis Testing and Statistical Analysis of Microbiome. Genes & Diseases. 4 (3), 138-148 (2017).
- Malla, M. A., et al. Exploring the Human Microbiome: The Potential Future Role of Next-Generation Sequencing in Disease Diagnosis and Treatment. Frontiers in Immunology. 9, 2868 (2018).
