Microbiota विश्लेषण दो कदम पीसीआर और अगली पीढ़ी के 16S rRNA जीन अनुक्रमण का उपयोग
Summary
यहाँ वर्णित 16S rRNA metagenomic अनुक्रमण और स्वतंत्र रूप से उपलब्ध उपकरणों का उपयोग कर विश्लेषण का उपयोग microbiome रूपरेखा के लिए एक सरलीकृत मानक ऑपरेटिंग प्रक्रिया है. इस प्रोटोकॉल शोधकर्ताओं जो microbiome क्षेत्र के लिए नए हैं और साथ ही तरीकों पर अद्यतन की आवश्यकता होती है एक उच्च संकल्प पर बैक्टीरियल प्रोफाइलिंग प्राप्त करने में मदद मिलेगी.
Abstract
मानव आंत बैक्टीरिया के अरबों है कि इस तरह के खाद्य चयापचय, ऊर्जा कटाई, और प्रतिरक्षा प्रणाली के विनियमन के रूप में शारीरिक कार्यों का समर्थन द्वारा उपनिवेश है. स्वस्थ आंत microbiome के क्षोभ एकाधिक काठिन्य (एमएस) सहित भड़काऊ रोगों के विकास में एक भूमिका निभाने के लिए सुझाव दिया गया है. पर्यावरण ीय और आनुवंशिक कारक माइक्रोबायोम की संरचना को प्रभावित कर सकते हैं; इसलिए, एक रोग phenotype के साथ जुड़े माइक्रोबियल समुदायों की पहचान स्वास्थ्य और रोग में microbiome की भूमिका को परिभाषित करने की दिशा में पहला कदम बन गया है. जीवाणु समुदाय की रूपरेखा के लिए 16S आरएनए मेटेनोमिक अनुक्रमण के उपयोग से माइक्रोबायोम अनुसंधान को आगे बढ़ाने में मदद मिली है। इसके व्यापक उपयोग के बावजूद, 16S rRNA-आधारित वर्गीकरण रूपरेखा विश्लेषण के लिए कोई एक समान प्रोटोकॉल नहीं है। एक अन्य सीमा इस तरह के छोटे अनुक्रमण पढ़ता है के रूप में तकनीकी कठिनाइयों के कारण वर्गीकरण असाइनमेंट के कम संकल्प है, साथ ही केवल आगे का उपयोग (R1) रिवर्स की कम गुणवत्ता के कारण अंतिम विश्लेषण में पढ़ता है (R2) पढ़ता है. एक दिए गए biospecimen में जीवाणु विविधता की विशेषता के लिए उच्च संकल्प के साथ एक सरलीकृत विधि की जरूरत है. अनुक्रमण प्रौद्योगिकी में प्रगति अनुक्रम करने की क्षमता के साथ अब उच्च संकल्प पर पढ़ता है इन चुनौतियों में से कुछ पर काबू पाने में मदद मिली है. वर्तमान अनुक्रमण प्रौद्योगिकी इस तरह के आर आधारित Divisive Amplicon Denoising एल्गोरिथ्म-2 (DADA2) के रूप में एक सार्वजनिक रूप से उपलब्ध metagenomic विश्लेषण पाइप लाइन के साथ संयुक्त उच्च संकल्प पर अग्रिम माइक्रोबियल प्रोफाइलिंग में मदद मिली है, के रूप में DADA2 जीनस पर अनुक्रम आवंटित कर सकते हैं और प्रजातियों के स्तर। यहाँ वर्णित 16S rRNA जीन के V3-V4 क्षेत्र के दो कदम प्रवर्धन का उपयोग कर जीवाणु रूपरेखा प्रदर्शन के लिए एक गाइड है, स्वतंत्र रूप से उपलब्ध विश्लेषण उपकरण का उपयोग कर विश्लेषण के बाद (यानी, DADA2, Phylosek, और METAGENassist). ऐसा माना जाता है कि यह सरल और पूर्ण कार्यप्रवाह माइक्रोबायोम प्रोफाइलिंग अध्ययन करने में रुचि रखने वाले शोधकर्ताओं के लिए एक उत्कृष्ट उपकरण के रूप में काम करेगा।
Introduction
माइक्रोबायोटा एक विशेष वातावरण में रहने वाले सूक्ष्मजीवों (बैक्टीरिया, वायरस, आर्किया, बैक्टीरियोफेज और कवक) के संग्रह को संदर्भित करता है, और माइक्रोबायोम निवासी सूक्ष्मजीवों के सामूहिक जीनोम को संदर्भित करता है। चूंकि बैक्टीरिया मनुष्यों और चूहों में सबसे प्रचुर मात्रा में रोगाणुओं में से एक है, यह अध्ययन केवल बैक्टीरियल प्रोफाइलिंग पर केंद्रित है। मानव आंत को खरबों बैक्टीरिया और सैकड़ों जीवाणु उपभेदों1द्वारा बसाया जाता है . सामान्य आंत microbiota कार्यों को विनियमित करने के द्वारा मेजबान में एक स्वस्थ राज्य को बनाए रखने में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है (यानी, एक बरकरार आंतों बाधा के रखरखाव, खाद्य चयापचय, ऊर्जा homeostasis, रोगजनक जीवों द्वारा उपनिवेशन के निषेध, और प्रतिरक्षा अनुक्रियाओं का विनियमन)2,3,4,5. आंत microbiota (गट डिस्बिओसिस) की compositional क्षुब्धता जठरांत्र संबंधीविकारों 6, मोटापा7,8, स्ट्रोक9, कैंसर10सहित मानव रोगों की एक संख्या से जोड़ा गया है , मधुमेह8,11, रूमेटोइड गठिया12, एलर्जी13, और केंद्रीय तंत्रिका तंत्र से संबंधित रोगों जैसे एकाधिक स्क्लेरोसिस (एमएस)14,15 और अल्जाइमर रोग (एडी)8,16. इसलिए, हाल के वर्षों में, विभिन्न शरीर स्थलों पर जीवाणु संरचना की पहचान करने के लिए उपकरणों में रुचि बढ़ रही है। एक विश्वसनीय विधि में उच्च-थ्रूपुट और उपयोग में आसान होने, उच्च संकल्प के साथ बैक्टीरियल माइक्रोबायोटा को वर्गीकृत करने की क्षमता होने, और कम लागत वाली विशेषताएं होनी चाहिए।
संस्कृति आधारित सूक्ष्मजीवी तकनीक कई आंत बैक्टीरिया की विफलता के कारण संस्कृति में विकसित होने के कारण जटिल आंत माइक्रोबायोम की पहचान करने और उनकी विशेषता के लिए पर्याप्त संवेदनशील नहीं हैं। अनुक्रमण आधारित प्रौद्योगिकी के आगमन, विशेष रूप से 16S rRNA आधारित metagenomic अनुक्रमण, इन चुनौतियों में से कुछ पर काबू पाने और microbiome अनुसंधान17बदल गया है. उन्नत 16S RNA आधारित अनुक्रमण प्रौद्योगिकी मानव स्वास्थ्य में आंत microbiome के लिए एक महत्वपूर्ण भूमिका स्थापित करने में मदद मिली है. मानव Microbiome परियोजना, स्वास्थ्य पहल के एक राष्ट्रीय संस्थान18, और MetaHIT परियोजना (एक यूरोपीय पहल)19 दोनों microbiome विश्लेषण के लिए एक बुनियादी ढांचे की स्थापना में मदद की है. इन पहलों ने मानव स्वास्थ्य और रोग में आंत माइक्रोबायोम की भूमिका निर्धारित करने के लिए कई अध्ययनों को शुरू करने में मदद की।
अनेक समूहों ने सूजन रोगों वाले रोगियों में आंत का अपस्फीति12,14,15,20,21,22दिखाया है . मल्टीप्लेक्स और कम लागत की क्षमता के कारण वर्गीकरण प्रोफाइलिंग के लिए व्यापक रूप से इस्तेमाल किया जा रहा होने के बावजूद, 16S RNA-आधारित वर्गीकरण रूपरेखा के लिए कोई समान प्रोटोकॉल नहीं हैं। एक अन्य सीमा छोटे अनुक्रमण पढ़ता है (150 bp या 250 bp) और केवल आगे अनुक्रमण पढ़ने का उपयोग करने के कारण वर्गीकरण कार्य के कम संकल्प है (R1) कम गुणवत्ता रिवर्स अनुक्रमण पढ़ता है (R2) के कारण. हालांकि, अनुक्रमण प्रौद्योगिकी में प्रगति के लिए इन चुनौतियों में से कुछ पर काबू पाने में मदद मिली है, इस तरह के अनुक्रम की क्षमता के रूप में अब युग्मित अंत पढ़ता का उपयोग पढ़ता है (जैसे, Illumina MiSeQ 2x300bp).
वर्तमान अनुक्रमण प्रौद्योगिकी अनुक्रम कर सकते हैं 600 बीपी अच्छी गुणवत्ता पढ़ता है, जो R1 और R2 के विलय की अनुमति देता है पढ़ता है. ये मर्ज किए गए अब R1 और R2 पढ़ता बेहतर वर्गीकरण कार्य की अनुमति दें, विशेष रूप से खुले उपयोग आर-आधारित Divisive Amplicon Denoising Algorithm-2 (DADA2) प्लेटफ़ॉर्म के साथ। DADA2 के बजाय परिचालन वर्गीकरण इकाई (OTU) कार्य QIIME23द्वारा उपयोग की समानता के आधार पर amplicon अनुक्रम संस्करण (ASV)-आधारित कार्य का इस्तेमाल करता है। ASV 1-2 न्यूक्लियोटाइड्स, जो जीनस और प्रजातियों के स्तर पर काम करने के लिए सुराग के भीतर डेटाबेस में एक सटीक अनुक्रम मैच में परिणाम से मेल खाता है। इस प्रकार, लंबे समय तक, अच्छी गुणवत्ता युग्मित अंत के संयोजन पढ़ता है और बेहतर वर्गीकरण असाइनमेंट उपकरण (जैसे DADA2) microbiome अध्ययन बदल दिया है.
लेकिन यहाँ 16S RRNA और डेटा विश्लेषण के V3-V4 क्षेत्र के दो कदम प्रवर्धन का उपयोग कर बैक्टीरियल प्रोफाइलिंग प्रदर्शन के लिए एक कदम दर कदम गाइड है DADA2, Phylosek, और METAGENassist पाइपलाइनों का उपयोग कर. इस अध्ययन के लिए मानव ल्यूकोसाइट प्रतिजन (एचएलए) श्रेणी के ट्रांसजेनिक चूहों का उपयोग किया जाता है, क्योंकि कुछ एचएलए श्रेणी के एलेल्स एमएस20,24,25जैसे ऑटोम्यून्यून रोगों के लिए एक पूर्वाग्रह से जुड़े हुए हैं। हालांकि, आंत microbiota की संरचना को विनियमित करने में HLA वर्ग द्वितीय जीन के महत्व अज्ञात है. यह hypothesized है कि HLA वर्ग द्वितीय अणु विशिष्ट बैक्टीरिया के लिए चयन करके आंत माइक्रोबियल समुदाय को प्रभावित करेगा. प्रमुख हिस्टो संगतता परिसर (MHC) वर्ग द्वितीय नॉकआउट चूहों (AE.KO) या चूहों मानव HLA-DQ8 अणुओं व्यक्त (HLA-DQ8)24,25,26 में HLA वर्ग द्वितीय अणुओं के महत्व को समझने के लिए इस्तेमाल किया गया आंत माइक्रोबियल समुदाय को आकार देने. ऐसा माना जाता है कि आर-आधारित डेटा विश्लेषण के साथ यह पूर्ण और सरलीकृत कार्यप्रवाह माइक्रोबायोम प्रोफाइलिंग अध्ययन करने में रुचि रखने वाले शोधकर्ताओं के लिए एक उत्कृष्ट उपकरण के रूप में काम करेगा।
चूहों की पीढ़ी अंतर्जात murine MHC वर्ग द्वितीय जीन की कमी (AE.KO) और एई-/ HLA-DQA1 *0103, DQB1 *0302 (HLA-DQ8) एक C57BL/6J पृष्ठभूमि के साथ ट्रांसजेनिक चूहों पहले26वर्णित किया गया है. मल के नमूने दोनों लिंगों (8-12 सप्ताह की उम्र) के चूहों से एकत्र किए जाते हैं। चूहे पहले पैदा कर रहे थे और NIH और संस्थागत दिशा निर्देशों के अनुसार आयोवा पशु सुविधा के विश्वविद्यालय में बनाए रखा. संदूषण नियंत्रण रणनीतियों जैसे एक लेमिनर प्रवाह कैबिनेट के अंदर चूहों की weaning, चूहों के विभिन्न उपभेदों के बीच दस्ताने के बदलने, और चूहों के उचित रखरखाव आंत microbiome की रूपरेखा के लिए महत्वपूर्ण कदम हैं.
उचित व्यक्तिगत सुरक्षात्मक उपकरण (PPE) अत्यधिक पूरी प्रक्रिया के दौरान की सिफारिश कर रहे हैं. डीएनए अलगाव प्रदर्शन करते समय उपयुक्त नकारात्मक नियंत्रण शामिल किया जाना चाहिए, PCR1 और PCR2 प्रवर्धन, और अनुक्रमण कदम. बाँझ का उपयोग, DNase मुक्त, RNase मुक्त, और pyrogen मुक्त आपूर्ति की सिफारिश की है. microbiome काम और फ़िल्टर किए गए पिपेट युक्तियों के लिए नामित पाइप्टर प्रोटोकॉल भर में इस्तेमाल किया जाना चाहिए। Microbiota विश्लेषण सात कदम के होते हैं: 1) मल नमूना संग्रह और प्रसंस्करण; 2) डीएनए की निकासी; 3) 16S rRNA जीन प्रवर्धन; 4) अनुक्रमित पीसीआर का उपयोग कर डीएनए पुस्तकालय निर्माण; 5) अनुक्रमित पीसीआर (लाइब्रेरी) की सफाई और परिमाणीकरण; 6) मिसेक अनुक्रमण; और 7) डेटा प्रसंस्करण और अनुक्रम विश्लेषण। सभी प्रोटोकॉल चरणों का एक योजनाबद्ध आरेख चित्र 1 में दर्शायागया है।
Protocol
Representative Results
Discussion
वर्णित प्रोटोकॉल सरल है, आसान करने के लिए पालन कदम के साथ microbiome रूपरेखा प्रदर्शन करने के लिए 16S rRNA metagenomic अनुक्रमण ब्याज की एक बड़ी संख्या से biospecimens. अगली पीढ़ी के अनुक्रमण ने माइक्रोबियल पारिस्थितिकी अध्ययनो?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखक NIAID/NIH (1R01AI137075-01), कार्वर ट्रस्ट मेडिकल रिसर्च इनिशिएटिव ग्रांट, और आयोवा पर्यावरण स्वास्थ्य विज्ञान अनुसंधान केंद्र, NIEHS/NIH (P30 ES005605) से धन स्वीकार करते हैं।
Materials
| 1.5 ml Natural Microcentriguge Tube | USA, Scientific | 1615-5500 | Fecal collection |
| 3M hand applicator squeegee PA1-G | 3M, MN, US | 7100038651 | Squeeger for proper sealing of PCR Plate |
| Agencourt AMPure XP | Beckman Coulter, IN, USA | A63880 | PCR Purification, NGS Clean-up, PCR clean-up |
| Agilent DNA 1000 REAGENT | Agilent Technologies, CA, USA | 5067-1504 | DNA quantification and quality control |
| Bioanalyzer DNA 1000 chip | Agilent Technologies, CA, USA | 5067-1504 | DNA quantification and quality control |
| Index Adopter Replacement Caps | Illumina, Inc., CA, USA | 15026762 | New cap for Index 1 and 2 adopter primer |
| DNeasy PowerLyzer PowerSoil Kit | MoBio now part of QIAGEN, Valencia, CA, USA | 12855-100 | DNA isolation |
| KAPA HiFi HotStart ReadyMiX (2X) | Kapa Biosystem, MA, USA | KK2602 | PCR ready mix for Amplicon PCR1 and Indexed PCR2 |
| Lewis Divider Boxes | Lewis Bins, WI, US | ND03080 | Fecal collection |
| Magnetic stand | New England BioLabs, MA, USA | S1509S | For PCR clean-up |
| MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate | Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific, CA, USA | 4346906 | PCR Plate |
| MicroAmp Optical Adhesive Film | Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific, CA, USA | 4311971 | PCR Plate Sealer |
| Microfuge 20 Centrifuge | Beckman Coulter, IN, USA | B30154 | Centrifuge used for DNA isolation |
| MiSeq Reagent Kit (600 cycles)v.3 | Illumina, Inc., CA, USA | MS-102-3003 | For MiSeq Sequencing |
| Nextera XT DNA Library Preparation Kit | Illumina, Inc., CA, USA | FC-131-1001 | 16S rRNA DNA Library Preparation |
| Reagent Reservoirs Multichannel Trays | ASI, FL,USA | RS71-1 | For Pooling of PCR2 Product |
| Plate Cetrifuge | Thermo Fisher Scientific, CA, USA | 75004393 | For PCR reagent mixing and removing air bubble from Plate |
| PhiX Control | Illumina, Inc., CA, USA | FC-110-3001 | For MiSeq Sequencing control |
| Microbiome DNA Purification Kit | Thermo Fisher Scientific, CA, USA | A29789 | For purification of PCR1 product |
| PowerLyzer 24 Homogenizer | Omni International, GA, USA | 19-001 | Bead beater for DNA Isolation |
| Qubit dsDNA HS (High Sensitivity) assay kit | Thermo Fisher Scientific, CA, USA | Q32854 | DNA quantification |
| TruSeq Index Plate Fixture | Illumina, Inc., CA, USA | FC-130-1005 | For Arranging of the index primers |
| Vertical Dividers (large) | Lewis Bins, WI, US | DV-2280 | Fecal collection |
| Vertical Dividers (small) | Lewis Bins, WI, US | DV-1780 | Fecal collection |
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