Análisis de microbiota utilizando PCR de dos pasos y secuenciación genética de rRNA 16S de próxima generación
Summary
Aquí se describe un procedimiento operativo estándar simplificado para la elaboración de perfiles de microbiomas mediante la secuenciación y el análisis metagenómicos de 16S rRNA utilizando herramientas disponibles gratuitamente. Este protocolo ayudará a los investigadores que son nuevos en el campo del microbioma, así como aquellos que requieren actualizaciones sobre los métodos para lograr el perfilado bacteriano a una resolución más alta.
Abstract
El intestino humano es colonizado por billones de bacterias que apoyan funciones fisiológicas como el metabolismo de los alimentos, la recolección de energía, y la regulación del sistema inmunológico. Se ha sugerido que la perturbación del microbioma intestinal sano desempeña un papel en el desarrollo de enfermedades inflamatorias, incluida la esclerosis múltiple (EP). Los factores ambientales y genéticos pueden influir en la composición del microbioma; por lo tanto, la identificación de comunidades microbianas vinculadas con un fenotipo de la enfermedad se ha convertido en el primer paso hacia la definición del papel del microbioma en la salud y la enfermedad. El uso de la secuenciación metagenómica de 16S rRNA para la generación de perfiles de la comunidad bacteriana ha ayudado a avanzar en la investigación del microbioma. A pesar de su amplio uso, no existe un protocolo uniforme para el análisis de perfiles taxonómicos basado según rRNA 16S. Otra limitación es la baja resolución de la asignación taxonómica debido a dificultades técnicas tales como lecturas de secuenciación más pequeñas, así como el uso de sólo lecturas hacia adelante (R1) en el análisis final debido a la baja calidad de lecturas inversas (R2). Es necesario un método simplificado con alta resolución para caracterizar la diversidad bacteriana en un bioespécme dado. Los avances en la tecnología de secuenciación con la capacidad de secuenciar lecturas más largas a alta resolución han ayudado a superar algunos de estos desafíos. La tecnología de secuenciación actual combinada con una canalización de análisis metagenómico disponible al público, como Divisive Amplicon Denoising Algorithm-2 (DADA2) basado en R, ha ayudado a avanzar en el perfilmicrobiano a alta resolución, ya que DADA2 puede asignar secuencia en el género y los niveles de especies. Aquí se describe una guía para realizar perfiles bacterianos utilizando amplificación en dos pasos de la región V3-V4 del gen rRNA 16S, seguido de un análisis utilizando herramientas de análisis disponibles libremente (es decir, DADA2, Phyloseq y METAGENassist). Se cree que este flujo de trabajo simple y completo servirá como una excelente herramienta para los investigadores interesados en realizar estudios de perfildeo de microbioma.
Introduction
Microbiota se refiere a una colección de microorganismos (bacterias, virus, arqueas, bacteriófagos y hongos) que viven en un entorno particular, y el microbioma se refiere al genoma colectivo de los microorganismos residentes. Como las bacterias son uno de los microbios más abundantes en humanos y ratones, este estudio se centra sólo en el perfil aseguir bacterias. El intestino humano es colonizado por billones de bacterias y cientos de cepas bacterianas1. La microbiota intestinal normal desempeña un papel vital en el mantenimiento de un estado saludable en el huésped mediante la regulación de las funciones (es decir, el mantenimiento de una barrera intestinal intacta, metabolismo alimentario, homeostasis energética, inhibición de la colonización por organismos patógenos, y regulación de las respuestas inmunitarias)2,3,4,5. Las perturbaciones compositivas de la microbiota intestinal (disbiosis intestinal) se han relacionado con una serie de enfermedades humanas, incluyendo trastornos gastrointestinales6, obesidad7,8, accidente cerebrovascular9, cáncer10, diabetes8,11, artritis reumatoide12, alergias13,y enfermedades relacionadas con el sistema nervioso central como la esclerosis múltiple (Mipymes)14,15 y Alzheimer enfermedad (AD)8,16. Por lo tanto, en los últimos años, ha habido un creciente interés en las herramientas para identificar la composición bacteriana en diferentes sitios del cuerpo. Un método confiable debe tener características tales como ser de alto rendimiento y fácil de usar, tener la capacidad de clasificar la microbiota bacteriana con alta resolución y ser de bajo costo.
Las técnicas microbiológicas basadas en el cultivo no son lo suficientemente sensibles como para identificar y caracterizar el microbioma intestinal complejo debido a la falta de varias bacterias intestinales para crecer en el cultivo. El advenimiento de la tecnología basada en la secuenciación, especialmente la secuenciación metagenómica basada en rRNA 16S, ha superado algunos de estos desafíos y transformado la investigación del microbioma17. La avanzada tecnología de secuenciación basada en rRNA 16S ha ayudado a establecer un papel crítico para el microbioma intestinal en la salud humana. El Proyecto Microbioma Humano, una iniciativa18de los Institutos Nacionales de Salud y el proyecto MetaHIT (una iniciativa europea)19 han ayudado a establecer un marco básico para el análisis de microbiomas. Estas iniciativas ayudaron a poner en marcha múltiples estudios para determinar el papel del microbioma intestinal en la salud humana y la enfermedad.
Varios grupos han mostrado disbiosis intestinal en pacientes con enfermedades inflamatorias12,14,15,20,21,22. A pesar de ser ampliamente utilizado para la generación de perfiles taxonómicos debido a la capacidad de multiplex y bajos costos, no hay protocolos uniformes para la generación de perfiles taxonómicos basados en rRNA 16S. Otra limitación es la baja resolución de la asignación taxonómica debido a lecturas de secuenciación más pequeñas (150 bp o 250 bp) y el uso de sólo lectura de secuenciación directa (R1) debido a lecturas de secuenciación inversa de baja calidad (R2). Sin embargo, los avances en la tecnología de secuenciación han ayudado a superar algunos de estos desafíos, como la capacidad de secuenciar lecturas más largas utilizando lecturas de extremo emparejado (por ejemplo, Illumina MiSeq 2x300bp).
La tecnología de secuenciación actual puede secuenciar lecturas de buena calidad de 600 bp, lo que permite la fusión de lecturas R1 y R2. Estas lecturas más largas R1 y R2 combinadas permiten mejores asignaciones taxonómicas, especialmente con la plataforma Divisive Amplicon Denoising Algorithm-2 (DADA2) basada en R de acceso abierto. DADA2 utiliza asignaciones basadas en variantes de secuencia de amplificación (ASV) en lugar de asignaciones de unidadtaxística operativa (OTU) basadas en una similitud del 97% utilizada por QIIME23. Las coincidencias ASV dan como resultado una coincidencia de secuencia exacta en la base de datos dentro de 1-2 nucleótidos, lo que conduce a la asignación a nivel de género y especie. Por lo tanto, la combinación de lecturas pares más largas y de buena calidad y mejores herramientas de asignación taxonómica (como DADA2) han transformado los estudios de microbioma.
Aquí se proporciona una guía paso a paso para realizar perfiles bacterianos mediante la amplificación en dos pasos de la región V3-V4 de rRNA 16S y análisis de datos mediante tuberías DADA2, Phyloseq y METAGENassist. Para este estudio, se utilizan ratones transgénicos de antígeno leucocito humano (HLA) clase II, ya que algunos alelos de clase II de HLA están vinculados con una predisposición a enfermedades autoinmunes como la MS20,24,25. Sin embargo, se desconoce la importancia de los genes HLA clase II para regular la composición de la microbiota intestinal. Se presume que la molécula HLA clase II influirá en la comunidad microbiana intestinal seleccionando para bacterias específicas. Principales ratones noqueantes de clase II del complejo de histocompatibilidad (MHC) (AE.KO) o ratones que expresan moléculas HLA-DQ8 humanas (HLA-DQ8)24,25,26 fueron utilizados para entender la importancia de las moléculas HLA clase II en moléculas HLA clase II en dar forma a la comunidad microbiana intestinal. Se cree que este flujo de trabajo completo y simplificado con análisis de datos basados en R servirá como una excelente herramienta para los investigadores interesados en realizar estudios de generación de perfiles de microbioma.
La generación de ratones que carecen de genes endógenos mandinos MHC clase II (AE.KO) y AE-/-. Los ratones transgénicos HLA-DQA1*0103, DQB1*0302 (HLA-DQ8) con un fondo C57BL/6J se han descrito anteriormente26. Las muestras fecales se recogen de ratones de ambos sexos (8-12 semanas de edad). Los ratones fueron criados y mantenidos previamente en las instalaciones de animales de la Universidad de Iowa de acuerdo con los NIH y las directrices institucionales. Las estrategias de control de la contaminación, como el destete de los ratones dentro de un gabinete de flujo laminar, el cambio de guantes entre diferentes cepas de ratones y el mantenimiento adecuado de los ratones, son pasos críticos para el perfilado del microbioma intestinal.
El equipo de protección personal (EPP) adecuado es muy recomendable durante todo el procedimiento. Se deben incluir controles negativos adecuados al realizar el aislamiento del ADN, la amplificación de PCR1 y PCR2 y los pasos de secuenciación. Se recomienda el uso de suministros estériles, libres de DNase, libres de RNase y libres de pirógenos. El pipeteador designado para el trabajo de microbioma y las puntas de pipeta filtradas se debe utilizar en todo el protocolo. El análisis de la microbiota consta de siete pasos: 1) recolección y procesamiento de muestras fecales; 2) extracción de ADN; 3) Amplificación del gen 16S rRNA; 4) Construcción de la biblioteca de ADN utilizando PCR indexado; 5) limpieza y cuantificación de LA PCR indexada (biblioteca); 6) Secuenciación MiSeq; y 7) procesamiento de datos y análisis de secuencias. En la Figura 1se muestra un diagrama esquemático de todos los pasos del protocolo.
Protocol
Representative Results
Discussion
El protocolo descrito es simple, con pasos fáciles de seguir para realizar perfiles de microbioma utilizando la secuenciación metagenómica de rRNA 16S de un gran número de biorespecímenes de interés. La secuenciación de próxima generación ha transformado los estudios de ecología microbiana, especialmente en los modelos de enfermedades humanas y preclínicas31,32. La principal ventaja de esta técnica es su capacidad para analizar con éxito composicione…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores reconocen la financiación del NIAID/NIH (1R01AI137075-01), la Beca Carver Trust Medical Research Initiative y el Centro de Investigación en Ciencias de la Salud Ambiental de la Universidad de Iowa, NIEHS/NIH (P30 ES005605).
Materials
| 1.5 ml Natural Microcentriguge Tube | USA, Scientific | 1615-5500 | Fecal collection |
| 3M hand applicator squeegee PA1-G | 3M, MN, US | 7100038651 | Squeeger for proper sealing of PCR Plate |
| Agencourt AMPure XP | Beckman Coulter, IN, USA | A63880 | PCR Purification, NGS Clean-up, PCR clean-up |
| Agilent DNA 1000 REAGENT | Agilent Technologies, CA, USA | 5067-1504 | DNA quantification and quality control |
| Bioanalyzer DNA 1000 chip | Agilent Technologies, CA, USA | 5067-1504 | DNA quantification and quality control |
| Index Adopter Replacement Caps | Illumina, Inc., CA, USA | 15026762 | New cap for Index 1 and 2 adopter primer |
| DNeasy PowerLyzer PowerSoil Kit | MoBio now part of QIAGEN, Valencia, CA, USA | 12855-100 | DNA isolation |
| KAPA HiFi HotStart ReadyMiX (2X) | Kapa Biosystem, MA, USA | KK2602 | PCR ready mix for Amplicon PCR1 and Indexed PCR2 |
| Lewis Divider Boxes | Lewis Bins, WI, US | ND03080 | Fecal collection |
| Magnetic stand | New England BioLabs, MA, USA | S1509S | For PCR clean-up |
| MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate | Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific, CA, USA | 4346906 | PCR Plate |
| MicroAmp Optical Adhesive Film | Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific, CA, USA | 4311971 | PCR Plate Sealer |
| Microfuge 20 Centrifuge | Beckman Coulter, IN, USA | B30154 | Centrifuge used for DNA isolation |
| MiSeq Reagent Kit (600 cycles)v.3 | Illumina, Inc., CA, USA | MS-102-3003 | For MiSeq Sequencing |
| Nextera XT DNA Library Preparation Kit | Illumina, Inc., CA, USA | FC-131-1001 | 16S rRNA DNA Library Preparation |
| Reagent Reservoirs Multichannel Trays | ASI, FL,USA | RS71-1 | For Pooling of PCR2 Product |
| Plate Cetrifuge | Thermo Fisher Scientific, CA, USA | 75004393 | For PCR reagent mixing and removing air bubble from Plate |
| PhiX Control | Illumina, Inc., CA, USA | FC-110-3001 | For MiSeq Sequencing control |
| Microbiome DNA Purification Kit | Thermo Fisher Scientific, CA, USA | A29789 | For purification of PCR1 product |
| PowerLyzer 24 Homogenizer | Omni International, GA, USA | 19-001 | Bead beater for DNA Isolation |
| Qubit dsDNA HS (High Sensitivity) assay kit | Thermo Fisher Scientific, CA, USA | Q32854 | DNA quantification |
| TruSeq Index Plate Fixture | Illumina, Inc., CA, USA | FC-130-1005 | For Arranging of the index primers |
| Vertical Dividers (large) | Lewis Bins, WI, US | DV-2280 | Fecal collection |
| Vertical Dividers (small) | Lewis Bins, WI, US | DV-1780 | Fecal collection |
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