Mikrobiota-analyse ved hjælp af to-trins PCR og næste generations 16S rRNA-Gensekvensering
Summary
Beskrevet her er en forenklet standard betjeningsprocedure for mikrobiome profilering ved hjælp af 16S rRNA metagenomanalyse sekvensering og analyse ved hjælp af frit tilgængelige værktøjer. Denne protokol vil hjælpe forskere, som er nye inden for mikrobiom-området, samt dem, der kræver opdateringer om metoder til at opnå bakteriel profilering ved en højere opløsning.
Abstract
Den menneskelige tarm er koloniseret af billioner af bakterier, der understøtter fysiologiske funktioner såsom fødevare metabolisme, energi høst, og regulering af immunsystemet. Perturbation af den sunde tarm mikrobiom er blevet foreslået at spille en rolle i udviklingen af inflammatoriske sygdomme, herunder multipel sklerose (MS). Miljømæssige og genetiske faktorer kan påvirke sammensætningen af mikrobiomet Derfor er identifikation af mikrobielle samfund, der er forbundet med en sygdoms fænotype, blevet det første skridt i retning af at definere mikrobiomes rolle i sundhed og sygdom. Brug af 16S rRNA metagenomanalyse sekventering for profilering bakteriel samfund har bidraget til at fremme mikrobiome forskning. På trods af sin brede anvendelse, er der ingen ensartet protokol for 16S rRNA-baseret taksonomisk profilering analyse. En anden begrænsning er den lave opløsning af taksonomisk tildeling på grund af tekniske vanskeligheder såsom mindre sekvensering læser, samt brug af kun Forward (R1) læser i den endelige analyse på grund af lav kvalitet af reverse (R2) læser. Der er behov for en forenklet metode med høj opløsning til at karakterisere bakteriel mangfoldighed i en given biopræparat. Fremskridt i sekvensering teknologi med evnen til at sekvens længere læser ved høj opløsning har bidraget til at overvinde nogle af disse udfordringer. Den nuværende sekvenserings teknologi kombineret med en offentligt tilgængelig metagenomisk analyse pipeline såsom R-baseret divisive Amplicon denoising algoritme-2 (DADA2) har medvirket til at fremme mikrobiel profilering ved høj opløsning, da DADA2 kan tildele sekvens på slægten og Arts niveauer. Beskrevet her er en guide til at udføre bakteriel profilering ved hjælp af to-trins forstærkning af v3-v4-regionen i 16S rRNA-genet, efterfulgt af analyse ved hjælp af frit tilgængelige analyseværktøjer (dvs. DADA2, Phyloseq og METAGENassist). Det menes, at denne enkle og komplette workflow vil tjene som et glimrende værktøj for forskere interesseret i at udføre mikrobiome profilering undersøgelser.
Introduction
Microbiota refererer til en samling af mikroorganismer (bakterier, vira, archaea, Bakteriofager og svampe), der lever i et bestemt miljø, og mikrobiomet refererer til det kollektive genom af residente mikroorganismer. Da bakterier er en af de mest udbredte mikrober i mennesker og mus, er denne undersøgelse kun fokuseret på bakteriel profilering. Den menneskelige tarm er koloniseret af trillioner af bakterier og hundredvis af bakteriestammer1. Den normale Gut mikrobiota spiller en afgørende rolle i at opretholde en sund tilstand i værten ved at regulere funktioner (dvs. vedligeholdelse af en intakt tarm barriere, føde stof metabolisme, energi homøostase, hæmning af kolonisering af patogene organismer, og regulering af immunrespons)2,3,4,5. Kompositoriske forstyrrelser af tarmen mikrobiota (Gut dysbiosis) har været forbundet med en række sygdomme hos mennesker, herunder gastrointestinale lidelser6, fedme7,8, slagtilfælde9, kræft10, diabetes8,11, reumatoid arthritis12, allergi13, og centrale nervesystem-relaterede sygdomme som multipel sklerose (MS)14,15 og Alzheimers sygdom (ad)8,16. Derfor har der i de senere år været stigende interesse for værktøjer til identificering af bakterie sammensætning på forskellige krops steder. En pålidelig metode bør have egenskaber såsom at være høj gennemløb og nem at bruge, der har evnen til at klassificere bakteriel mikrobiota med høj opløsning, og er lave omkostninger.
Kulturbaserede mikrobiologiske teknikker er ikke følsomme nok til at identificere og karakterisere den komplekse tarm mikrobiom på grund af svigt af flere tarm bakterier til at vokse i kulturen. Fremkomsten af den Sequencing-baserede teknologi, især 16S rRNA-baserede metagenomanalyse Sequencing, har overvundet nogle af disse udfordringer og omdannet mikrobiome forskning17. Advanced 16S rRNA-baseret sekvente Rings teknologi har hjulpet med at etablere en kritisk rolle for tarm mikrobiomet i menneskers sundhed. Det humane Mikrobiome-projekt, et nationalt Institut for sundhedsinitiativ18, og MetaHIT-projektet (et europæisk initiativ)19 har begge medvirket til at etablere en grundlæggende ramme for mikrobiomome analyse. Disse initiativer bidrog til at kickstarte flere undersøgelser for at bestemme den rolle, som tarm mikrobiomet spiller for menneskers sundhed og sygdom.
En række grupper har vist Gut dysbiosis hos patienter med inflammatoriske sygdomme12,14,15,20,21,22. Selv om det er almindeligt anvendt til taksonomisk profilering på grund af evnen til at multiplex og lave omkostninger, er der ingen ensartede protokoller for 16S rRNA-baseret taksonomisk profilering. En anden begrænsning er den lave opløsning af taksonomisk tildeling på grund af mindre sekvensering af læsninger (150 BP eller 250 BP) og brug af kun fremad sekvensering læst (R1) på grund af lav kvalitet reverse sekventering læser (R2). Men, fremskridt i sekvensering teknologi har bidraget til at overvinde nogle af disse udfordringer, såsom evnen til at sekvens længere læser ved hjælp af parret-end læser (f. eks Illumina MiSeq 2x300bp).
Den nuværende sekvensering teknologi kan sekvens 600 BP god kvalitet læser, som tillader sammenlægning af R1 og R2 læser. Disse fusionerede længere R1 og R2 læser giver bedre taksonomiske tildelinger, især med åben adgang R-baseret divisive Amplicon denoising algoritme-2 (DADA2) platform. DADA2 bruger amplikonen Sequence variant (ASV)-baserede tildelinger i stedet for operationelle taksonomiske Unit (otu)-tildelinger baseret på 97% lighed udnyttet af qiime23. ASV kampe resulterer i en nøjagtig sekvens match i databasen inden for 1 – 2 nucleotider, hvilket fører til tildeling på slægten og Arts niveauer. Kombinationen af længere, kvalitetsmæssige og bedre taksonomiske tildelings værktøjer (som f. eks. DADA2) har således forvandlet mikrobiome studier.
Forudsat her er en trin-for-trin guide til udførelse af bakteriel profilering ved hjælp af to-trins forstærkning af v3-v4-regionen 16S rRNA og dataanalyse ved hjælp af DADA2, Phyloseq og METAGENassist pipelines. Til denne undersøgelse anvendes humane leukocytantigen (HLA) klasse II-Transgene mus, da visse HLA klasse II-alleler er forbundet med en disposition for autoimmune sygdomme som MS20,24,25. Men, betydningen af HLA klasse II gener i reguleringen af sammensætningen af Gut mikrobiota er ukendt. Det er en hypotese, at HLA klasse II molekyle vil påvirke Gut mikrobielle samfund ved at vælge for specifikke bakterier. Major komplekse Complex (MHC) klasse II Knockout-mus (AE. ko) eller mus, der udtrykker humane HLA-DQ8-molekyler (HLA-DQ8)24,25,26 blev anvendt for at forstå betydningen af HLA-klasse II-molekyler i forme tarm mikrobielle samfund. Det menes, at denne komplette og forenklede arbejdsgang med R-baseret dataanalyse vil tjene som et glimrende redskab for forskere, der er interesseret i at udføre mikrobiome profilering undersøgelser.
Generation af mus mangler endogene murine MHC klasse II gener (AE. KO) og AE-/-. HLA-DQA1 * 0103, DQB1 * 0302 (HLA-DQ8) Transgene mus med en C57BL/6J baggrund er blevet beskrevet tidligere26. Fækale prøver opsamles fra mus af begge køn (8 – 12 ugers alderen). Mus blev tidligere opdrættet og vedligeholdt i University of Iowa Animal facilitet som pr NIH og institutionelle retningslinjer. Forurenings bekæmpelses strategier såsom fravænning af musene inde i et laminar flow kabinet, udskiftning af handsker mellem forskellige stammer af mus og korrekt vedligeholdelse af mus er kritiske trin til profilering af Gut-mikrobiome.
Korrekt personligt beskyttelsesudstyr (PPE) anbefales stærkt under hele proceduren. Passende negative kontroller bør medtages, når der udføres DNA-isolation, PCR1 og PCR2 forstærkning, og sekvensering trin. Brug af sterile, DNase-fri, RNase-fri og pyrogen-fri forsyninger anbefales. Der skal anvendes en udpeget pipette til mikrobiome arbejde og filtrerede pipettespidser i hele protokollen. Mikrobiota analyse består af syv trin: 1) fækal prøveindsamling og behandling; 2) udvinding af DNA; 3) 16S rRNA-genamplifikation; 4) DNA-Biblioteks konstruktion ved hjælp af indekseret PCR; 5) oprydning og kvantificering af indekseret PCR (bibliotek); 6) MiSeq sekvensering; og 7) databehandling og Sekvensanalyse. Der vises et skematisk diagram over alle protokol trin i figur 1.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den beskrevne protokol er enkel, med nemme at følge trin til at udføre mikrobiome profilering ved hjælp af 16S rRNA metagenomanalyse sekvensering fra et stort antal bioeksemplarer af interesse. Næste generations sekvensering har forvandlet mikrobielle økologi studier, især i humane og prækliniske sygdomsmodeller31,32. Den største fordel ved denne teknik er dens evne til med succes at analysere komplekse mikrobielle kompositioner (culturable og ikke-cultur…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne anerkender finansiering fra NIAID/NIH (1R01AI137075-01), Carver Trust medicinsk forskningsinitiativ Grant, og University of Iowa Environmental Health Sciences Research Center, NIEHS/NIH (P30 ES005605).
Materials
| 1.5 ml Natural Microcentriguge Tube | USA, Scientific | 1615-5500 | Fecal collection |
| 3M hand applicator squeegee PA1-G | 3M, MN, US | 7100038651 | Squeeger for proper sealing of PCR Plate |
| Agencourt AMPure XP | Beckman Coulter, IN, USA | A63880 | PCR Purification, NGS Clean-up, PCR clean-up |
| Agilent DNA 1000 REAGENT | Agilent Technologies, CA, USA | 5067-1504 | DNA quantification and quality control |
| Bioanalyzer DNA 1000 chip | Agilent Technologies, CA, USA | 5067-1504 | DNA quantification and quality control |
| Index Adopter Replacement Caps | Illumina, Inc., CA, USA | 15026762 | New cap for Index 1 and 2 adopter primer |
| DNeasy PowerLyzer PowerSoil Kit | MoBio now part of QIAGEN, Valencia, CA, USA | 12855-100 | DNA isolation |
| KAPA HiFi HotStart ReadyMiX (2X) | Kapa Biosystem, MA, USA | KK2602 | PCR ready mix for Amplicon PCR1 and Indexed PCR2 |
| Lewis Divider Boxes | Lewis Bins, WI, US | ND03080 | Fecal collection |
| Magnetic stand | New England BioLabs, MA, USA | S1509S | For PCR clean-up |
| MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate | Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific, CA, USA | 4346906 | PCR Plate |
| MicroAmp Optical Adhesive Film | Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific, CA, USA | 4311971 | PCR Plate Sealer |
| Microfuge 20 Centrifuge | Beckman Coulter, IN, USA | B30154 | Centrifuge used for DNA isolation |
| MiSeq Reagent Kit (600 cycles)v.3 | Illumina, Inc., CA, USA | MS-102-3003 | For MiSeq Sequencing |
| Nextera XT DNA Library Preparation Kit | Illumina, Inc., CA, USA | FC-131-1001 | 16S rRNA DNA Library Preparation |
| Reagent Reservoirs Multichannel Trays | ASI, FL,USA | RS71-1 | For Pooling of PCR2 Product |
| Plate Cetrifuge | Thermo Fisher Scientific, CA, USA | 75004393 | For PCR reagent mixing and removing air bubble from Plate |
| PhiX Control | Illumina, Inc., CA, USA | FC-110-3001 | For MiSeq Sequencing control |
| Microbiome DNA Purification Kit | Thermo Fisher Scientific, CA, USA | A29789 | For purification of PCR1 product |
| PowerLyzer 24 Homogenizer | Omni International, GA, USA | 19-001 | Bead beater for DNA Isolation |
| Qubit dsDNA HS (High Sensitivity) assay kit | Thermo Fisher Scientific, CA, USA | Q32854 | DNA quantification |
| TruSeq Index Plate Fixture | Illumina, Inc., CA, USA | FC-130-1005 | For Arranging of the index primers |
| Vertical Dividers (large) | Lewis Bins, WI, US | DV-2280 | Fecal collection |
| Vertical Dividers (small) | Lewis Bins, WI, US | DV-1780 | Fecal collection |
References
- Lynch, S. V., Pedersen, O. The Human Intestinal Microbiome in Health and Disease. New England Journal of Medicine. 375 (24), 2369-2379 (2016).
- Blacher, E., Levy, M., Tatirovsky, E., Elinav, E. Microbiome-Modulated Metabolites at the Interface of Host Immunity. Journal of Immunology. 198 (2), 572-580 (2017).
- Jarchum, I., Pamer, E. G. Regulation of innate and adaptive immunity by the commensal microbiota. Current Opinion in Immunology. 23 (3), 353-360 (2011).
- Rescigno, M. The intestinal epithelial barrier in the control of homeostasis and immunity. Trends in Immunology. 32 (6), 256-264 (2011).
- Zhang, K., Hornef, M. W., Dupont, A. The intestinal epithelium as guardian of gut barrier integrity. Cell Microbiology. 17 (11), 1561-1569 (2015).
- Ghoshal, U. C., Park, H., Gwee, K. A. Bugs and irritable bowel syndrome: The good, the bad and the ugly. Journal of Gastroenterology and Hepatology. 25 (2), 244-251 (2010).
- Ley, R. E., Turnbaugh, P. J., Klein, S., Gordon, J. I. Microbial ecology: human gut microbes associated with obesity. Nature. 444 (7122), 1022-1023 (2006).
- Naseer, M. I., et al. Role of gut microbiota in obesity, type 2 diabetes and Alzheimer’s disease. CNS & Neurological Disorders – Drug Targets. 13 (2), 305-311 (2014).
- Yin, J., et al. Dysbiosis of Gut Microbiota With Reduced Trimethylamine-N-Oxide Level in Patients With Large-Artery Atherosclerotic Stroke or Transient Ischemic Attack. Journal of American Heart Association. 4 (11), (2015).
- Azcarate-Peril, M. A., Sikes, M., Bruno-Barcena, J. M. The intestinal microbiota, gastrointestinal environment and colorectal cancer: a putative role for probiotics in prevention of colorectal cancer. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 301 (3), 401-424 (2011).
- Su, M., et al. Diversified gut microbiota in newborns of mothers with gestational diabetes mellitus. PLoS ONE. 13 (10), 0205695 (2018).
- Horta-Baas, G., et al. Intestinal Dysbiosis and Rheumatoid Arthritis: A Link between Gut Microbiota and the Pathogenesis of Rheumatoid Arthritis. Journal of Immunological Research. , 4835189 (2017).
- Panzer, A. R., Lynch, S. V. Influence and effect of the human microbiome in allergy and asthma. Current Opinion in Rheumatology. 27 (4), 373-380 (2015).
- Chen, J., et al. Multiple sclerosis patients have a distinct gut microbiota compared to healthy controls. Science Reports. 6, 28484 (2016).
- Tremlett, H., et al. Gut microbiota composition and relapse risk in pediatric MS: A pilot study. Journal of Neurological Science. 363, 153-157 (2016).
- Pistollato, F., et al. Role of gut microbiota and nutrients in amyloid formation and pathogenesis of Alzheimer disease. Nutritional Reviews. 74 (10), 624-634 (2016).
- Caporaso, J. G., et al. Global patterns of 16S rRNA diversity at a depth of millions of sequences per sample. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 108, 4516-4522 (2011).
- Turnbaugh, P. J., et al. The human microbiome project. Nature. 449 (7164), 804-810 (2007).
- Dusko Ehrlich, S. Meta, H.I.T.c. Metagenomics of the intestinal microbiota: potential applications. Gastroenterologie Clinique et Biologique. 34, 23-28 (2010).
- Jangi, S., et al. Alterations of the human gut microbiome in multiple sclerosis. Nature Communications. 7, 12015 (2016).
- Miyake, S., et al. Dysbiosis in the Gut Microbiota of Patients with Multiple Sclerosis, with a Striking Depletion of Species Belonging to Clostridia XIVa and IV Clusters. PLoS ONE. 10 (9), 0137429 (2015).
- Shahi, S. K., Freedman, S. N., Mangalam, A. K. Gut microbiome in multiple sclerosis: The players involved and the roles they play. Gut Microbes. 8 (6), 607-615 (2017).
- Callahan, B. J., et al. DADA2: High-resolution sample inference from Illumina amplicon data. Nature Methods. 13 (7), 581-583 (2016).
- Das, P., et al. Complementation between specific HLA-DR and HLA-DQ genes in transgenic mice determines susceptibility to experimental autoimmune encephalomyelitis. Human Immunology. 61 (3), 279-289 (2000).
- Mangalam, A. K., Rajagopalan, G., Taneja, V., David, C. S. HLA class II transgenic mice mimic human inflammatory diseases. Advances in Immunology. 97, 65-147 (2008).
- Mangalam, A., et al. HLA-DQ8 (DQB1*0302)-restricted Th17 cells exacerbate experimental autoimmune encephalomyelitis in HLA-DR3-transgenic mice. Journal of Immunology. 182 (8), 5131-5139 (2009).
- Kiernan, M. G., et al. The Human Mesenteric Lymph Node Microbiome Differentiates Between Crohn’s Disease and Ulcerative Colitis. Journal of Crohn’s & Colitis. 13 (1), 58-66 (2019).
- McMurdie, P. J., Holmes, S. phyloseq: an R package for reproducible interactive analysis and graphics of microbiome census data. PLoS ONE. 8 (4), 61217 (2013).
- Arndt, D., et al. METAGENassist: a comprehensive web server for comparative metagenomics. Nucleic Acids Research. 40, 88-95 (2012).
- Hugerth, L. W., Andersson, A. F. Analysing Microbial Community Composition through Amplicon Sequencing: From Sampling to Hypothesis Testing. Frontiers in Microbiology. 8, 1561 (2017).
- Srinivasan, R., et al. Use of 16S rRNA gene for identification of a broad range of clinically relevant bacterial pathogens. PLoS ONE. 10 (2), 0117617 (2015).
- Didelot, X., Bowden, R., Wilson, D. J., Peto, T. E. A., Crook, D. W. Transforming clinical microbiology with bacterial genome sequencing. Nature Reviews Genetics. 13 (9), 601-612 (2012).
- Buermans, H. P., den Dunnen, J. T. Next generation sequencing technology: Advances and applications. Biochimica et Biophysica Acta. 1842 (10), 1932-1941 (2014).
- Cai, L., Ye, L., Tong, A. H., Lok, S., Zhang, T. Biased diversity metrics revealed by bacterial 16S pyrotags derived from different primer sets. PLoS ONE. 8 (1), 53649 (2013).
- Kuczynski, J., et al. Experimental and analytical tools for studying the human microbiome. Nature Reviews Genetics. 13 (1), 47-58 (2011).
- Mangalam, A., et al. Human Gut-Derived Commensal Bacteria Suppress CNS Inflammatory and Demyelinating Disease. Cell Reports. 20 (6), 1269-1277 (2017).
- Shahi, S. K., et al. Prevotella histicola, A Human Gut Commensal, Is as Potent as COPAXONE(R) in an Animal Model of Multiple Sclerosis. Frontiers in Immunology. 10, 462 (2019).
- Bliss, D. Z., et al. Comparison of subjective classification of stool consistency and stool water content. Journal of Wound Ostomy & Continence Nursing. 26 (3), 137-141 (1999).
- Kim, D., et al. Optimizing methods and dodging pitfalls in microbiome research. Microbiome. 5 (1), 52 (2017).
- Sinha, R., et al. Collecting Fecal Samples for Microbiome Analyses in Epidemiology Studies. Cancer Epidemiology, Biomarkers & Prevention. 25 (2), 407-416 (2016).
- Salonen, A., et al. Comparative analysis of fecal DNA extraction methods with phylogenetic microarray: effective recovery of bacterial and archaeal DNA using mechanical cell lysis. Journal of Microbiological Methods. 81 (2), 127-134 (2010).
- Santiago, A., et al. Processing faecal samples: a step forward for standards in microbial community analysis. BMC Microbiology. 14, 112 (2014).
- Glassing, A., Dowd, S. E., Galandiuk, S., Davis, B., Chiodini, R. J. Inherent bacterial DNA contamination of extraction and sequencing reagents may affect interpretation of microbiota in low bacterial biomass samples. Gut Pathogens. 8, 24 (2016).
- Salter, S. J., et al. Reagent and laboratory contamination can critically impact sequence-based microbiome analyses. BMC Biology. 12, 87 (2014).
- Weiss, S., et al. Tracking down the sources of experimental contamination in microbiome studies. Genome Biology. 15 (12), 564 (2014).
- Lozupone, C., Lladser, M. E., Knights, D., Stombaugh, J., Knight, R. UniFrac: an effective distance metric for microbial community comparison. ISME Journal. 5 (2), 169-172 (2011).
- Schloss, P. D. Evaluating different approaches that test whether microbial communities have the same structure. ISME Journal. 2 (3), 265-275 (2008).
- Xia, Y., Sun, J. Hypothesis Testing and Statistical Analysis of Microbiome. Genes & Diseases. 4 (3), 138-148 (2017).
- Malla, M. A., et al. Exploring the Human Microbiome: The Potential Future Role of Next-Generation Sequencing in Disease Diagnosis and Treatment. Frontiers in Immunology. 9, 2868 (2018).
