Her presenteres en trinnvis fremgangsmåte for å indusere akutt lungeskade hos mus ved direkte intratrakeal lipopolysakkarid drypping og for å utføre FACS analyse av blodprøver, lunges tømming og lunge vev. Minimal invasiveness, enkel håndtering, god reproduserbarhet og titrering av alvorlighetsgraden av sykdommen er fordelene med denne tilnærmingen.
Luftveis administrering av lipopolysakkarid (LPS) er en vanlig måte å studere lungebetennelse og akutt lungeskade (ALI) i små dyremodeller. Ulike tilnærminger har blitt beskrevet, slik som inhalasjon av aerosolized LPS samt nasal eller intratrakeal drypping. Den presenterte protokollen beskriver en detaljert trinn-for-trinn prosedyre for å indusere ALI i mus ved direkte intratrakeal LPS drypping og utføre FACS analyse av blodprøver, lunges tømming (BAL) væske, og lunge vev. Etter intraperitoneal sedasjon, luftrøret er eksponert og LPS administreres via en 22 G venøs kateter. En robust og reproduserbar inflammatorisk reaksjon med leukocytter invasjon, oppregulering av proinflammatoriske cytokiner, og forstyrrelse av alveolo-kapillær barriere er indusert i løpet av timer til dager, avhengig av LPS dosering brukt. Innsamling av blodprøver, BAL-væske, og lunge høsting, samt behandling for FACS analyse, er beskrevet i detalj i protokollen. Selv om bruken av den sterile LPS-en ikke er egnet til å studere Pharmacologic intervensjoner i smittsomme sykdommer, tilbyr den beskrevne tilnærmingen minimalt invasiveness, enkel håndtering og god reproduserbarhet for å besvare mekanistisk immunologiske spørsmål. Videre, dosetitrering samt bruk av alternative LPS preparater eller mus stammer tillate modulering av de kliniske effektene, som kan vise ulike grader av ALI alvorlighetsgrad eller tidlig g. sen utbruddet av sykdomssymptomer.
Eksperimentelle dyremodeller er uunnværlig i grunnleggende immun forskning. Administrasjon av hele bakterier eller mikrobielle komponenter har blitt hyppig brukt i små dyremodeller for å indusere lokal eller systemisk betennelse1. Lipopolysakkarid (LPS, eller bakteriell endotoksin) er en cellevegg komponent og overflateantigen av gram-negative bakterier (f. eks, Enterobacteriaceae, Pseudomonas spp., eller Legionella spp.). Det thermostable og store molekylet (molekylvekt 1-4 x 106 KDA) består av en lipid moiety (lipid a), kjerne region (Oligosaccharide), og en o polysakkarid (eller O antigen). Lipid A, med sine hydrofobe fettsyrer kjeder, forankrer molekylet til en bakteriell membran og formidler (ved nedbrytning av bakterier) den immunologiske aktivitet og toksisitet av LPS. Etter binding til LPS bindende protein (LBP), LPS: LBP komplekser ombinde CD14/TLR4/MD2 reseptoren komplekset ligger på overflaten av mange celletyper, inducing en sterk proinflammatoriske reaksjon med NF-KB kjernefysiske translokasjon og påfølgende oppregulering av cytokin uttrykk2.
Akutt lungeskade (ALI) er definert som akutt hypoksemirespirasjonssvikt respirasjonssvikt med bilateral lungeødem i fravær av hjertesvikt3. Luftveis administrering av LPS er en vanlig måte å indusere lungebetennelse og Ali4,5,6,7. Selv om det sterile stoffet ikke er egnet til å studere Pharmacologic intervensjoner i smittsomme sykdommer, kan mekanistisk immunologiske spørsmål besvares med tilstrekkelig presisjon. Drypping av LPS inn i luftrøret induserer en robust inflammatorisk reaksjon med leukocytter invasjon, oppregulering av proinflammatoriske cytokiner, og forstyrrelse av alveolo-kapillær barriere i løpet av timer til dager, avhengig av LPS dosering3, 6,7.
Den presenterte protokollen beskriver en detaljert trinn-for-trinn prosedyre for å indusere ALI i mus ved intratrakeal LPS drypping. Modellen har blitt validert ved å vurdere cytokin uttrykk, nøytrofile granulocytt invasjon, og intra-alveolære albumin lekkasje som tidligere beskrevet8.
Minimal invasiveness, enkel håndtering, og god reproduserbarhet er viktige funksjoner i den presenterte tilnærmingen for å indusere ALI i en liten gnager modell. Bruk av LPS i stedet for hele bakterier i dyremodeller har fordeler. Det er en stabil og ren sammensatte og kan lagres i lyofilisert form til bruk. Det er en potent stimulerende for medfødte immunresponser via TLR4 veien, og dens biologiske aktivitet kan lett bli kvantifisert, tilrettelegge for titrering av sykdom alvorlighetsgrad med god reproduserbarhet. V…
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne ønsker å takke Jan Kleiner og Susanne Schulz for å gi teknisk støtte. Forfatterne erkjenner utmerket støtte av flyten flowcytometri kjernen anlegget ved medisinsk fakultet Bonn University. Forfatterne fikk ingen støtte fra noen ekstern organisasjon. Deler av dataene i resultat seksjonen og avbildet i Figur 3 er allerede vist i en tidligere publikasjon8.
1 ml syringes | BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 300013 | |
10 ml syringes | BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 309110 | |
Anti-CD115 (c-fms) APC | Thermo Fisher, Waltham, MA, USA | 17-1152-80 | |
Anti-CD11b (M1/70) – FITC | Thermo Fisher, Waltham, MA, USA | 11-0112-81 | |
Anti-CD45 (30-F11) – eF450 | Thermo Fisher, Waltham, MA, USA | 48-0451-82 | |
Anti-F4/80 (BM-8) – PE Cy7 | Thermo Fisher, Waltham, MA, USA | 25-4801-82 | |
Anti-Gr1 (RB6-8C5) | BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA | 552093 | |
Anti-Ly6C (HK1.4) PerCP-Cy5.5 | Thermo Fisher, Waltham, MA, USA | 45-5932-82 | |
Anti-Ly6G (1A8) APC/Cy7 | Bio Legend, San Diego, CA | 127623 | |
Buprenorphine hydrochloride | Indivior UK Limited, Berkshire, UK | ||
C57BL/6 mice, female, 10 – 12 weeks old | Charles River, Wilmongton, MA, USA | ||
CaliBRITE APC-beads (6µm) | BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA | 340487 | |
Canula 23 gauge 1'' | BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 300800 | |
Canula 26 gauge 1/2'' | BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 303800 | |
Cell strainer 70 µm | BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA | 352350 | |
Collagenase Type I | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | 1148089 | |
Deoxyribonuclease II | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | D8764 | |
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS), sterile | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | D8662 | |
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (PBS), without calcium chloride and magnesium chloride, sterile | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | D8537 | |
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) solution | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | E7889 | |
FACS tubes, 5 ml | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 551579 | |
Fetal calf serum (FCS) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | F2442 | |
Forceps | Fine Science Tools, Heidelberg, Germany | 11049-10 | |
Isoflurane | Baxter, Unterschleißheim, Germany | ||
Ketamine hydrochloride | Serumwerk Bernburg, Bernburg, Germany | ||
Lipopolysaccharides (LPS) from Escherichia coli O111:B4 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | L2630 | |
LIVE/DEAD Fixable Dead Cell Green Kit | Thermo Fisher, Waltham, MA, USA | L23101 | |
Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block™), Clone 2.4G2 | BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 553141 | |
Red blood cell lysis buffer | Thermo Fisher, Waltham, MA, USA | 00-4333-57 | |
RPMI-1640, with L-glutamine and sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | R8758 | |
Scissors | Fine Science Tools, Heidelberg, Germany | 14060-09 | |
Sodium azide (NaN3) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | S2002 | |
Spring scissors | Fine Science Tools, Heidelberg, Germany | 15018-10 | |
Tissue forceps | Fine Science Tools, Heidelberg, Germany | 11021-12 | |
Tubes | Eppendorf, Hamburg, Germany | 30125150 | |
Venous catheter, 22 gauge | B.Braun, Melsungen, Germany | 4268091B | |
Xylazine hydrochloride | Serumwerk Bernburg, Bernburg, Germany |