Inducing akutt lungeskade i mus ved direkte Intratrakeal lipopolysakkarid drypping

Summary

Her presenteres en trinnvis fremgangsmåte for å indusere akutt lungeskade hos mus ved direkte intratrakeal lipopolysakkarid drypping og for å utføre FACS analyse av blodprøver, lunges tømming og lunge vev. Minimal invasiveness, enkel håndtering, god reproduserbarhet og titrering av alvorlighetsgraden av sykdommen er fordelene med denne tilnærmingen.

Abstract

Luftveis administrering av lipopolysakkarid (LPS) er en vanlig måte å studere lungebetennelse og akutt lungeskade (ALI) i små dyremodeller. Ulike tilnærminger har blitt beskrevet, slik som inhalasjon av aerosolized LPS samt nasal eller intratrakeal drypping. Den presenterte protokollen beskriver en detaljert trinn-for-trinn prosedyre for å indusere ALI i mus ved direkte intratrakeal LPS drypping og utføre FACS analyse av blodprøver, lunges tømming (BAL) væske, og lunge vev. Etter intraperitoneal sedasjon, luftrøret er eksponert og LPS administreres via en 22 G venøs kateter. En robust og reproduserbar inflammatorisk reaksjon med leukocytter invasjon, oppregulering av proinflammatoriske cytokiner, og forstyrrelse av alveolo-kapillær barriere er indusert i løpet av timer til dager, avhengig av LPS dosering brukt. Innsamling av blodprøver, BAL-væske, og lunge høsting, samt behandling for FACS analyse, er beskrevet i detalj i protokollen. Selv om bruken av den sterile LPS-en ikke er egnet til å studere Pharmacologic intervensjoner i smittsomme sykdommer, tilbyr den beskrevne tilnærmingen minimalt invasiveness, enkel håndtering og god reproduserbarhet for å besvare mekanistisk immunologiske spørsmål. Videre, dosetitrering samt bruk av alternative LPS preparater eller mus stammer tillate modulering av de kliniske effektene, som kan vise ulike grader av ALI alvorlighetsgrad eller tidlig g. sen utbruddet av sykdomssymptomer.

Introduction

Eksperimentelle dyremodeller er uunnværlig i grunnleggende immun forskning. Administrasjon av hele bakterier eller mikrobielle komponenter har blitt hyppig brukt i små dyremodeller for å indusere lokal eller systemisk betennelse¹. Lipopolysakkarid (LPS, eller bakteriell endotoksin) er en cellevegg komponent og overflateantigen av gram-negative bakterier (f. eks, Enterobacteriaceae, Pseudomonas spp., eller Legionella spp.). Det thermostable og store molekylet (molekylvekt 1-4 x 10⁶ KDA) består av en lipid moiety (lipid a), kjerne region (Oligosaccharide), og en o polysakkarid (eller O antigen). Lipid A, med sine hydrofobe fettsyrer kjeder, forankrer molekylet til en bakteriell membran og formidler (ved nedbrytning av bakterier) den immunologiske aktivitet og toksisitet av LPS. Etter binding til LPS bindende protein (LBP), LPS: LBP komplekser ombinde CD14/TLR4/MD2 reseptoren komplekset ligger på overflaten av mange celletyper, inducing en sterk proinflammatoriske reaksjon med NF-KB kjernefysiske translokasjon og påfølgende oppregulering av cytokin uttrykk².

Akutt lungeskade (ALI) er definert som akutt hypoksemirespirasjonssvikt respirasjonssvikt med bilateral lungeødem i fravær av hjertesvikt³. Luftveis administrering av LPS er en vanlig måte å indusere lungebetennelse og Ali^4,5,6,7. Selv om det sterile stoffet ikke er egnet til å studere Pharmacologic intervensjoner i smittsomme sykdommer, kan mekanistisk immunologiske spørsmål besvares med tilstrekkelig presisjon. Drypping av LPS inn i luftrøret induserer en robust inflammatorisk reaksjon med leukocytter invasjon, oppregulering av proinflammatoriske cytokiner, og forstyrrelse av alveolo-kapillær barriere i løpet av timer til dager, avhengig av LPS dosering^{3, 6,7}.

Den presenterte protokollen beskriver en detaljert trinn-for-trinn prosedyre for å indusere ALI i mus ved intratrakeal LPS drypping. Modellen har blitt validert ved å vurdere cytokin uttrykk, nøytrofile granulocytt invasjon, og intra-alveolære albumin lekkasje som tidligere beskrevet⁸.

Protocol

Dette dyret protokollen ble godkjent av den lokale komiteen for dyr omsorg (LANUV, Recklinghausen, Tyskland; protokoll nr. 84-02.04.2015) og ble utført i samsvar med National Institutes of Health retningslinjer for bruk av levende dyr (NIH publikasjon Nr. 85-23, revidert 1996). 1. ALI induksjon Bruk voksen C57BL/6 mus i alderen av ca 10-12 uker. Huset dyrene i individuelt ventilert bur med fri tilgang til vann og standard gnager Chow. Det er imidlertid mulig å utføre denne tilnær…

Representative Results

Den beskrevne tilnærmingen til å indusere ALI i mus ble validert ved å vurdere cytokin uttrykk, nøytrofile granulocytt infiltrasjon, og alveolo-kapillær barriere avbrudd 24 h og 72 h etter LPS drypping. PBS-injisert dyr fungerte som kontroll. Intratrakeal LPS administrasjon indusert en robust lunge proinflammatoriske respons. Uttrykk for TNF-α i lungevevet var signifikant upregulated, nådde en varig og mer enn 50-fold økning sammenlignet med kontroll dyrene [RQ (TNF-α/18s); 24 h: 53,7 (SD = 11,6); 72 h: 55,0 (SD…

Discussion

Minimal invasiveness, enkel håndtering, og god reproduserbarhet er viktige funksjoner i den presenterte tilnærmingen for å indusere ALI i en liten gnager modell. Bruk av LPS i stedet for hele bakterier i dyremodeller har fordeler. Det er en stabil og ren sammensatte og kan lagres i lyofilisert form til bruk. Det er en potent stimulerende for medfødte immunresponser via TLR4 veien, og dens biologiske aktivitet kan lett bli kvantifisert, tilrettelegge for titrering av sykdom alvorlighetsgrad med god reproduserbarhet. V…

Materials

1 ml syringes	BD, Franklin Lakes, NJ, USA	300013
10 ml syringes	BD, Franklin Lakes, NJ, USA	309110
Anti-CD115 (c-fms) APC	Thermo Fisher, Waltham, MA, USA	17-1152-80
Anti-CD11b (M1/70) – FITC	Thermo Fisher, Waltham, MA, USA	11-0112-81
Anti-CD45 (30-F11) – eF450	Thermo Fisher, Waltham, MA, USA	48-0451-82
Anti-F4/80 (BM-8) – PE Cy7	Thermo Fisher, Waltham, MA, USA	25-4801-82
Anti-Gr1 (RB6-8C5)	BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA	552093
Anti-Ly6C (HK1.4) PerCP-Cy5.5	Thermo Fisher, Waltham, MA, USA	45-5932-82
Anti-Ly6G (1A8) APC/Cy7	Bio Legend, San Diego, CA	127623
Buprenorphine hydrochloride	Indivior UK Limited, Berkshire, UK
C57BL/6 mice, female, 10 – 12 weeks old	Charles River, Wilmongton, MA, USA
CaliBRITE APC-beads (6µm)	BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA	340487
Canula 23 gauge 1''	BD, Franklin Lakes, NJ, USA	300800
Canula 26 gauge 1/2''	BD, Franklin Lakes, NJ, USA	303800
Cell strainer 70 µm	BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA	352350
Collagenase Type I	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	1148089
Deoxyribonuclease II	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	D8764
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS), sterile	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	D8662
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (PBS), without calcium chloride and magnesium chloride, sterile	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	D8537
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) solution	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	E7889
FACS tubes, 5 ml	Sarstedt, Nümbrecht, Germany	551579
Fetal calf serum (FCS)	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	F2442
Forceps	Fine Science Tools, Heidelberg, Germany	11049-10
Isoflurane	Baxter, Unterschleißheim, Germany
Ketamine hydrochloride	Serumwerk Bernburg, Bernburg, Germany
Lipopolysaccharides (LPS) from Escherichia coli O111:B4	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	L2630
LIVE/DEAD Fixable Dead Cell Green Kit	Thermo Fisher, Waltham, MA, USA	L23101
Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block™), Clone 2.4G2	BD, Franklin Lakes, NJ, USA	553141
Red blood cell lysis buffer	Thermo Fisher, Waltham, MA, USA	00-4333-57
RPMI-1640, with L-glutamine and sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	R8758
Scissors	Fine Science Tools, Heidelberg, Germany	14060-09
Sodium azide (NaN3)	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	S2002
Spring scissors	Fine Science Tools, Heidelberg, Germany	15018-10
Tissue forceps	Fine Science Tools, Heidelberg, Germany	11021-12
Tubes	Eppendorf, Hamburg, Germany	30125150
Venous catheter, 22 gauge	B.Braun, Melsungen, Germany	4268091B
Xylazine hydrochloride	Serumwerk Bernburg, Bernburg, Germany