Индуцирование острая травма легких у мышей путем прямого внутричехального липополисахарида интиллация
Summary
Представлено здесь пошаговая процедура, чтобы вызвать острую травму легких у мышей путем прямого внутричехального липополисахарида закапывания и для выполнения FACS анализ образцов крови, бронхоальвеолярной жидкости для вавания, и легочной ткани. Минимальная инвазивность, простая обработка, хорошая воспроизводимость, и титрование тяжести заболевания являются преимуществами этого подхода.
Abstract
Администрация дыхательных путей липополисахарида (LPS) является распространенным способом изучения воспаления легких и острой травмы легких (ALI) в малых моделей животных. Были описаны различные подходы, такие как вдыхание аэрозольных ЛПС, а также носовое или внутримагистральное заволакивание. Представленный протокол описывает подробную пошаговую процедуру, чтобы вызвать АЛИ у мышей путем прямого внутрипеченого зависания ЛПС и выполнения анализа FACS образцов крови, бронхоальвеолярной провай (BAL) жидкости и легочной ткани. После интраперитонеальной седации трахея подвергается воздействию и LPS вводится через 22 G венозного катетера. Надежная и воспроизводимая воспалительная реакция с нашествием лейкоцитов, upregulation провоспалительных цитокинов, и нарушение альвеоло-капиллярного барьера индуцируется в течение нескольких часов до нескольких дней, в зависимости от дозы LPS используется. Сбор образцов крови, BAL жидкости, и вырубка легких, а также обработки для анализа FACS, подробно описаны в протоколе. Хотя использование стерильных LPS не подходит для изучения фармакологических вмешательств при инфекционных заболеваниях, описанный подход предлагает минимальную инвазивность, простое обращение и хорошую воспроизводимость для ответа на механистические иммунологические вопросы. Кроме того, доза титрации, а также использование альтернативных препаратов LPS или мыши штаммов позволяют модуляции клинических эффектов, которые могут проявлять различные степени али тяжести или раннего против позднего начала симптомов заболевания.
Introduction
Экспериментальные модели животных незаменимы в фундаментальных иммунных исследованиях. Администрация целых бактерий или микробных компонентов часто используется в небольшихмоделях животных, чтобы вызвать местное или системное воспаление 1. Липополисахарид (LPS, или бактериальный эндотоксин) является компонентом стенки клетки и поверхностным антигеном грамотрицательных бактерий (например, Enterobacteriaceae, Pseudomonas spp., или Legionella spp.). Термостабильная и большая молекула (молекулярный вес 1-4 х 106 кДА) состоит из липидного муати (Липид A), основной области (олигосахарид) и ополисахарида (или O антигена). Липид А, с его гидрофобными цепями жирных кислот, закрепляет молекулу в бактериальной мембране и опосредует (после деградации бактерий) иммунологическую активность и токсичность ЛПС. После связывания с связывающим белком LPS (LBP), комплексы LPS:LBP сводят сягирование рецепторного комплекса CD14/TLR4/MD2, расположенного на поверхности многих типов клеток, вызывая сильную провоспалительную реакцию с ядерной транслокацией NF-QB и последующее регулирование цитокинов выражение2.
Острая травма легких (АЛИ) определяется как острая гипоксемическая дыхательная недостаточность с двусторонним отеком легких при отсутствии сердечной недостаточности3. Администрация дыхательных путей LPS является распространенным способом вызвать воспаление легких и ALI4,5,6,7. Хотя стерильное вещество не подходит для изучения фармакологических вмешательств при инфекционных заболеваниях, на механистические иммунологические вопросы можно ответить с достаточной точностью. Привитие ЛПС в трахею вызывает надежную воспалительную реакцию с нашествием лейкоцитов, upregulation провоспалительных цитокинов, и нарушение альвеоло-капиллярного барьера в течение нескольких часов до нескольких дней, в зависимости от дозировки LPS3, 6,7.
Представленный протокол описывает подробную пошаговую процедуру, чтобы вызвать АЛИ у мышей путем внутричехального зависания ЛПС. Модель была подтверждена путем оценки экспрессии цитокинов, нейтрофилов гранулоцитов вторжения, и внутриальвеолярной утечки альбумин, как ранее описано8.
Protocol
Representative Results
Discussion
Минимальная инвазивность, простая обработка и хорошая воспроизводимость являются ключевыми особенностями представленного подхода, чтобы побудить ALI в небольшой модели грызунов. Использование LPS вместо целых бактерий в животных моделях имеет свои преимущества. Это стабильное и чисто?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы хотели бы поблагодарить Яна Кляйнера и Сюзанну Шульц за техническую поддержку. Авторы признают отличную поддержку потока цитометрии основной объект на медицинском факультете Боннского университета. Авторы не получали финансирования от какой-либо внешней организации. Часть данных, приведенных в разделе результатов и изображенных на рисунке 3, уже была показана в предыдущей публикации8.
Materials
| 1 ml syringes | BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 300013 | |
| 10 ml syringes | BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 309110 | |
| Anti-CD115 (c-fms) APC | Thermo Fisher, Waltham, MA, USA | 17-1152-80 | |
| Anti-CD11b (M1/70) – FITC | Thermo Fisher, Waltham, MA, USA | 11-0112-81 | |
| Anti-CD45 (30-F11) – eF450 | Thermo Fisher, Waltham, MA, USA | 48-0451-82 | |
| Anti-F4/80 (BM-8) – PE Cy7 | Thermo Fisher, Waltham, MA, USA | 25-4801-82 | |
| Anti-Gr1 (RB6-8C5) | BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA | 552093 | |
| Anti-Ly6C (HK1.4) PerCP-Cy5.5 | Thermo Fisher, Waltham, MA, USA | 45-5932-82 | |
| Anti-Ly6G (1A8) APC/Cy7 | Bio Legend, San Diego, CA | 127623 | |
| Buprenorphine hydrochloride | Indivior UK Limited, Berkshire, UK | ||
| C57BL/6 mice, female, 10 – 12 weeks old | Charles River, Wilmongton, MA, USA | ||
| CaliBRITE APC-beads (6µm) | BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA | 340487 | |
| Canula 23 gauge 1'' | BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 300800 | |
| Canula 26 gauge 1/2'' | BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 303800 | |
| Cell strainer 70 µm | BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA | 352350 | |
| Collagenase Type I | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | 1148089 | |
| Deoxyribonuclease II | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | D8764 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS), sterile | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | D8662 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (PBS), without calcium chloride and magnesium chloride, sterile | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | D8537 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) solution | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | E7889 | |
| FACS tubes, 5 ml | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 551579 | |
| Fetal calf serum (FCS) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | F2442 | |
| Forceps | Fine Science Tools, Heidelberg, Germany | 11049-10 | |
| Isoflurane | Baxter, Unterschleißheim, Germany | ||
| Ketamine hydrochloride | Serumwerk Bernburg, Bernburg, Germany | ||
| Lipopolysaccharides (LPS) from Escherichia coli O111:B4 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | L2630 | |
| LIVE/DEAD Fixable Dead Cell Green Kit | Thermo Fisher, Waltham, MA, USA | L23101 | |
| Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block™), Clone 2.4G2 | BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 553141 | |
| Red blood cell lysis buffer | Thermo Fisher, Waltham, MA, USA | 00-4333-57 | |
| RPMI-1640, with L-glutamine and sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | R8758 | |
| Scissors | Fine Science Tools, Heidelberg, Germany | 14060-09 | |
| Sodium azide (NaN3) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | S2002 | |
| Spring scissors | Fine Science Tools, Heidelberg, Germany | 15018-10 | |
| Tissue forceps | Fine Science Tools, Heidelberg, Germany | 11021-12 | |
| Tubes | Eppendorf, Hamburg, Germany | 30125150 | |
| Venous catheter, 22 gauge | B.Braun, Melsungen, Germany | 4268091B | |
| Xylazine hydrochloride | Serumwerk Bernburg, Bernburg, Germany |
References
- Fink, M. P. Animal models of sepsis. Virulence. 5 (1), 143-153 (2014).
- Lu, Y. -. C., Yeh, W. -. C., Ohashi, P. S. LPS/TLR4 signal transduction pathway. Cytokine. 42 (2), 145-151 (2008).
- Matute-Bello, G., Frevert, C. W., Martin, T. R. Animal models of acute lung injury. American Journal of Physiology – Lung Cellular and Molecular Physiology. 295 (3), 379-399 (2008).
- Rabelo, M. A. E., et al. Acute Lung Injury in Response to Intratracheal Instillation of Lipopolysaccharide in an Animal Model of Emphysema Induced by Elastase. Inflammation. 41 (1), 174-182 (2018).
- Liu, F., Li, W., Pauluhn, J., Trübel, H., Wang, C. Lipopolysaccharide-induced acute lung injury in rats: comparative assessment of intratracheal instillation and aerosol inhalation. Toxicology. 304, 158-166 (2013).
- Rittirsch, D., et al. Acute Lung Injury Induced by Lipopolysaccharide Is Independent of Complement Activation. Journal of Immunology. 180 (11), 7664-7672 (2008).
- D’Alessio, F. R., et al. CD4+CD25+Foxp3+ Tregs resolve experimental lung injury in mice and are present in humans with acute lung injury. The Journal of Clinical Investigation. 119 (10), 2898-2913 (2009).
- Ehrentraut, H., Weisheit, C., Scheck, M., Frede, S., Hilbert, T. Experimental murine acute lung injury induces increase of pulmonary TIE2-expressing macrophages. Journal of Inflammation. 15, 12 (2018).
- Szarka, R. J., Wang, N., Gordon, L., Nation, P. N., Smith, R. H. A murine model of pulmonary damage induced by lipopolysaccharide via intranasal instillation. Journal of Immunological Methods. 202 (1), 49-57 (1997).
- Reutershan, J., Basit, A., Galkina, E. V., Ley, K. Sequential recruitment of neutrophils into lung and bronchoalveolar lavage fluid in LPS-induced acute lung injury. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 289 (5), 807-815 (2005).
- Hoegl, S., et al. Capturing the multifactorial nature of ARDS – approach to model murine acute lung injury. Physiological Reports. 6 (6), (2018).
- Weisheit, C., et al. Ly6Clow and Not Ly6Chigh Macrophages Accumulate First in the Heart in a Model of Murine Pressure-Overload. PLoS ONE. 9 (11), (2014).
- Grommes, J., Soehnlein, O. Contribution of Neutrophils to Acute Lung Injury. Molecular Medicine. 17 (3-4), 293-307 (2011).
- Müller-Redetzky, H. C., Suttorp, N., Witzenrath, M. Dynamics of pulmonary endothelial barrier function in acute inflammation: mechanisms and therapeutic perspectives. Cell and Tissue Research. 355 (3), 657-673 (2014).
- Fujita, M., et al. Endothelial cell apoptosis in lipopolysaccharide-induced lung injury in mice. International Archives of Allergy and Immunology. 117 (3), 202-208 (1998).
- Doyen, V., et al. Inflammation induced by inhaled lipopolysaccharide depends on particle size in healthy volunteers. British Journal of Clinical Pharmacology. 82 (5), 1371-1381 (2016).
- Stephens, R. S., Johnston, L., Servinsky, L., Kim, B. S., Damarla, M. The tyrosine kinase inhibitor imatinib prevents lung injury and death after intravenous LPS in mice. Physiological Reports. 3 (11), (2015).
- Yu, Y., Jing, L., Zhang, X., Gao, C. Simvastatin Attenuates Acute Lung Injury via Regulating CDC42-PAK4 and Endothelial Microparticles. Shock. 47 (3), 378-384 (2017).
