핵산 프로브를 이용한 뉴클레아제 활성의 운동 스크리닝
Summary
변경된 뉴클레아제 활성은 바이오마커로서의 잠재력을 기점으로 다른 인간 조건과 연관되어 있다. 이 논문에 제시된 모듈식 및 구현 방법론은 뉴클레아제 활성을 질병의 바이오마커로 활용하기 위한 특정 핵산 프로브를 선택할 수 있게 한다.
Abstract
뉴클레아제는 리보오스 설탕을 연결하는 인산 분해 결합의 가수분해를 촉매하여 핵산을 분해하는 효소의 한 부입니다. 핵약은 원핵 생물과 진핵 생물에서 다양한 중요한 생리적 역할을 나타내며, 게놈 안정성 유지에서 병원균에 대한 보호 제공에 이르기까지 다양합니다. 변경된 뉴클레아제 활동은 세균성 감염 및 암을 포함하여 몇몇 병리학적인 조건과 연관되었습니다. 이를 위해, 뉴클레아제 활성은 특정 바이오마커로서 악용될 수 있는 큰 잠재력을 보여주었다. 그러나, 이 활성에 기초한 견고하고 재현 가능한 스크리닝 방법은 매우 바람직하다.
본 명세서에서, 우리는 병리학적 및 건강한 상태 사이의 분화의 범위와 함께, 기질로서 핵산 프로브를 사용하여 뉴클레아제 활성을 스크리닝가능하게 하는 방법을 소개한다. 이 방법을 사용하면 반복적인 방식으로 특이성이 증가하면서 새로운 프로브 라이브러리를 설계할 수 있습니다. 따라서 화학적으로 변형된 핵산의 가용성을 활용하여 향상된 기능으로 프로브의 설계를 구체화하기 위해 여러 라운드의 스크리닝이 필요합니다. 제안된 기술의 상당한 잠재력은 질병 상태와 관련된 핵활성의 스크리닝을 위한 유연성, 높은 재현성 및 다기능성에 있다. 이 기술은 클리닉에서 큰 잠재력을 가진 유망한 진단 도구의 개발을 허용 할 것으로 예상된다.
Introduction
뉴클레아제는 핵산 분자의 백본 구조를 형성하는 인산염 결합을 분리할 수 있는 효소의 부류입니다. 뉴클레아제의 광대 한 다양성은 그들의 분류를 오히려 어렵게 만듭니다. 그러나, 기질 선호도(deoxyribonucleic acid (DNA) 또는 리보핵산 (RNA)), 절단 부위 (엔도누클레스 또는 외핵약), 또는 금속 이온 의존성, 다른 사람의 사이에서 뉴클레아제를 기술하는 데 사용되는 몇 가지 일반적인 기준이있다 1. 핵활성제는 원핵생물및 진핵생물 모두에서 근본적인 역할을 가지며, 유전자 편집도구로서계속 사용되고 있는 고도로 보존된 촉매 효소이다 2. 그(것)들은 또한 DNA 정비 및 복제에 있는 기본적인 배우입니다, 게놈 안정성을 지키는 것을 돕고 증명 독서 프로세스에참여3. 박테리아에서, 예를 들어, 뉴클레아제는 숙주의 면역 계통의 효능을 감소시킴으로써 세균 생존을 촉진할 수 있는 중요한 독성 인자로 확인되었다4,5,6,7 ,8. 포유동물에서, 뉴클레아제는 세포자멸9,미토콘드리아 생물발생 및유지보수(10) 및 항균 및 항바이러스 선천적 면역 반응의 중재에 연루되는 것으로 제안되었다11. 당연히, 뉴클레아제 활성 변경, 향상 또는 부족 여부, 인간의 질병의 넓은 배열에 연루 되었습니다. 이들 질환은 다양한 암12,13, 심장 비대10 또는 자가면역질환(14)에이르기까지 다양합니다. 따라서, 뉴클레아제는 인간 조건의 이기종 그룹에 대한 바이오마커로서 흥미로운 후보가 되었다. 사실, 뉴클레아제는 이미 황색포도상구균 또는 대장균15와같은 특정 세균성 에이전트에 기인한 감염의 검출을 위한 성공적인 진단 공구로 그들의 잠재력을 보여주었습니다15, 16.많은 암 유형에서, 포도상 구균 뉴클레아제 도메인-함유 단백질 1(SND1) 리보뉴클레아제의 발현은 예후불량을 나타낸다17. 췌장암 환자에서, 높은 리보누클러스 I(RNase I) 혈청 수준은18로 보고되고 암세포 표현형19와연관될 것으로 제안되었다. 허혈성 심장 조건에서, 예컨대 심근경색 또는 불안정한 협심증, 디옥시리보누클리스 I(DNase I) 혈청 수준은 유효한 진단마커(20,21)로나타났다.
뉴클레아제 활성의 글로벌 청사진이 건강하고 질병 상태에서 다를 수 있다는 가설이 있습니다. 실제로, 최근 보고는 뉴클레아제 활성의 차이를 사용하여 건강한표현형(22)을 구별하거나 종별 방식으로 병원성 세균 감염을 식별하기 위해15,23을사용하였다. 이 사실 인정은 질병의 biomarkers로 뉴클레아제의 사용을 위한 새로운 길을 열었습니다. 따라서, 뉴클레아제 활성의 질병 관련 차이를 체계적으로 식별할 수 있는 포괄적인 스크리닝 방법의 개발이 필요하게 되는데, 이는 새로운 진단 도구의 개발에 매우 중요할 수 있다.
본 명세서에서, 우리는 건강하고 건강에 해로운, 또는 세포 또는 박테리아의 종류에 특이적인 활성에서 뉴클레아제 활성 을 구별할 수 있는 민감하고 특이적인 프로브를 식별하기 위해 새로운 시험관내 스크리닝접근법(도 1)을소개하고 기술한다. 핵산의 모듈성을 활용하여, 우리는 서로 다른 서열과 화학의 포괄적인 세트로 구성된 담금질 형광 올리고뉴클레오티드 프로브의 초기 라이브러리를 설계, 둘 다 라이브러리 설계를위한 중요한 매개 변수인. 이들 올리고뉴클레오티드 프로브는 각각 5′ 및 3′ 말단에서 플루오로포르(플루오레세인 아미드, FAM) 및 퀘이커(tide quencher 2, TQ2)에 의해 측면에있다(표 1). 이 형광 공명 에너지 전달 (FRET) 기반형광 분석법을 사용하여 효소 분해의 역학을 측정함으로써, 우리는 뉴클레아제 활성의 차동 패턴을 구별 할 수있는 후보 프로브를 식별 할 수있었습니다. 건강 또는 질병 상태와 관련이 있습니다. 우리는 후속 선별 단계에서 더욱 구체적인 후보 프로브를 식별할 수 있는 최상의 후보 프로브를 기반으로 새로운 라이브러리를 만드는 반복 프로세스를 설계했습니다. 더욱이, 이 접근은 감도를 증가시키기 위하여 뉴클레아제의 촉매 특성을 이용합니다. 이는 리포터 프로브의 활성 특성과 뉴클레아제의 기질 분자를 지속적으로 처리하는 능력을 활용함으로써 달성되며, 대체 항체 또는 소분자 기반 스크리닝 방법에 비해 주요 이점을 나타냅니다.
이 접근법은 건강 상태와 질병 상태를 구별할 수 있는 특정 핵산 프로브의 식별을 위한 고도로 모듈화되고 유연하며 구현하기 쉬운 스크리닝 도구를 제공하며, 새로운 개발을 위한 훌륭한 플랫폼을 제공합니다. 향후 임상 응용 분야에 맞게 조정할 수 있는 진단 도구입니다. 이와 같이, 이러한 접근법은 살모넬라 티피무리움(이하 살모넬라균)으로부터유래된 뉴클레아제 활성을 이 박테리아의 특이적 식별을 위해 식별하는데 사용되었다. 다음 프로토콜에서, 우리는 운동 분석을 사용하여 세균성 뉴클레아제 활성을 스크리는 방법에 대해 보고한다.
Protocol
Representative Results
Discussion
뉴클레아제 활성의 변경은 다양한 유형의 암 및 세균 감염을 포함한 다양한 질병 표현형과 연관되어 왔다. 이러한 변화는 조건14의원인인 것으로 제안되며, 다른 경우에는 해로운 생리적사건(20) 또는 병원성제제(16,26)의결과이다. 당연히, 진단 바이오마커로서 뉴클레아제 및 뉴클레아제 활성을 사용하려는 시도는 상?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 루이자 I. 에르난데스 (링셰핑 대학)가 원고와 귀중한 조언을 신중하게 수정한 것을 인정하고 싶습니다. 이 작품은 Knut와 앨리스 Wallenberg 재단과 링셰핑 대학에서 고급 기능성 재료에 재료 과학에 스웨덴 정부 전략 연구 영역에 의해 지원되었다 (교수 그랜트 SFO-Mat-LiU 번호 2009-00971).
Materials
| Black bottom, non-treated 96 well plate | Fisher Scientific | 10000631 | |
| Cytation1 | BioTek | CYT1FAV | |
| Eppendorf tubes | Thermofisher | 11926955 | |
| Escherichia coli | ATCC | 25922 | |
| Microbank cryogenic storage vial containing beads | Pro-Lab Diagnostics | 22-286-155 | |
| Nucleic acid probes | Biomers.net | # | |
| Phosphate Buffer Saline containing MgCl2 and CaCl2 | Gibco™ | 14040117 | |
| Salmonella enterica subs. Enterica | ATCC | 14028 | |
| Tris-EDTA | Fisher Scientific | 10647633 | |
| Tryptone Soya Agar with defibrinated sheep blood | Thermo Fisher Scientific | 10362223 | |
| Tryptic Soy Broth | Sigma Aldrich | 22092 |
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