Dépistage cinétique de l'activité nucléane à l'aide de sondes d'acide nucléique
Summary
L’activité altérée de nucléase a été associée à différentes conditions humaines, sous-jacenteà son potentiel en tant que biomarqueur. La méthodologie modulaire et facile à mettre en œuvre de criblage présentée dans ce document permet la sélection des sondes spécifiques d’acide nucléique pour exploiter l’activité de nucléane comme biomarqueur de la maladie.
Abstract
Les nucléases sont une classe d’enzymes qui décomposent les acides nucléiques en catalysant l’hydrolyse des liaisons phosphodiester qui relient les sucres ribose. Les nucléases présentent une variété de rôles physiologiques vitaux dans les organismes procaryotes et eucaryotes, allant du maintien de la stabilité du génome à la protection contre les agents pathogènes. L’activité modifiée de nucléase a été associée à plusieurs conditions pathologiques comprenant des infections bactériennes et le cancer. À cette fin, l’activité de nucléane a montré un grand potentiel d’exploitation comme biomarqueur spécifique. Cependant, une méthode de dépistage robuste et reproductible basée sur cette activité demeure hautement souhaitable.
Ici, nous introduisons une méthode qui permet le criblage pour l’activité de nucléane utilisant des sondes d’acide nucléique comme substrats, avec la portée de différencier entre les conditions pathologiques et saines. Cette méthode offre la possibilité de concevoir de nouvelles bibliothèques de sondes, avec une spécificité croissante, d’une manière itérative. Ainsi, plusieurs séries de criblage sont nécessaires pour affiner la conception des sondes avec des caractéristiques améliorées, en profitant de la disponibilité d’acides nucléiques chimiquement modifiés. Le potentiel considérable de la technologie proposée réside dans sa flexibilité, sa haute reproductibilité et sa polyvalence pour le dépistage de l’activité nucléase associée aux maladies. On s’attend à ce que cette technologie permette le développement d’outils diagnostiques prometteurs avec un grand potentiel dans la clinique.
Introduction
Les nucléases sont une classe d’enzymes capables de ciquer les liaisons phosphodiester qui forment la structure dorsale des molécules d’acide nucléique. La grande diversité des nucléases rend leur classification assez difficile. Cependant, certains critères communs sont utilisés pour décrire les nucléases, comme la préférence pour le substrat (acide désoxyribonucléique (ADN) ou acide ribonucléique (ARN), le site de clivage (endonucleases ou exonuclées), ou la dépendance aux ions métalliques, entre autres1. Les nucléases sont des enzymes catalytiques hautement conservées qui ont des rôles fondamentaux dans les organismes procaryotes et eucaryotes et ont été utilisées, et continuent d’être utilisées, comme outils d’édition de gènes2. Ils sont également des acteurs fondamentaux dans l’entretien et la réplication de l’ADN, aidant à maintenir la stabilité du génome et participant aux processus de relecture3. Chez les bactéries, par exemple, les nucléases ont été identifiées comme des facteurs de virulence importants, capables de promouvoir la survie bactérienne en réduisant l’efficacité du système immunitaire de l’hôte4,5,6,7 ,8. Chez les mammifères, on a suggéré que les nucléases soient impliquées dans l’apoptose9, la biogenèse et l’entretien mitochondriaux10 et la médiation des réponses immunitaires innées antibactériennes et antivirales11. Comme on pouvait s’y attendre, des altérations de l’activité nucléane, qu’elles soient améliorées ou en l’absence, ont été impliquées dans un large éventail de maladies humaines. Ces maladies vont d’une grande variété de cancers12,13 à l’hypertrophie cardiaque10 ou les maladies auto-immunes14. Par conséquent, les nucléases sont devenues des candidats intéressants comme biomarqueurs pour un groupe hétérogène de conditions humaines. En fait, les nucléases ont déjà démontré leur potentiel en tant qu’outils de diagnostic efficaces pour la détection des infections causées par des agents bactériens spécifiques, tels que Staphylococcus aureus ou Escherichia coli15, 16. Dans beaucoup de types de cancer, l’expression de la protéine de domaine de nucléase staphylococcique-contenante 1 (SND1) ribonuclease est indicative du pronostic pauvre17. Dans les patients de cancer pancréatique, les niveaux élevés de sérum de ribonuclease I (RNase I) ont été rapportés18 et ont proposé d’être associés aux phénotypes cancéreux de cellules19. Dans les affections cardiaques ischémiques, telles que l’infarctus du myocarde ou l’angine de poitrine instable, les niveaux de sérum de désoxyribonuclease I (DNase I) se sont avérés être un marqueur diagnostique valide20,21.
On a émis l’hypothèse que le plan global de l’activité nucléase peut être différent dans les états sains et les états de maladie. En fait, des rapports récents ont utilisé des différences dans l’activité nucléase pour distinguer entre les phénotypes sains et cancéreux22 ou pour identifier les infections bactériennes pathogènes d’une manière spécifique à l’espèce15,23. Ces résultats ont ouvert une nouvelle voie pour l’utilisation des nucléases comme biomarqueurs de la maladie. Par conséquent, il est nécessaire de mettre au point une méthode de dépistage complète capable d’identifier systématiquement les différences associées à la maladie dans l’activité nucléase, qui peuvent être d’une importance capitale dans le développement de nouveaux outils de diagnostic.
Dans ce cas, nous introduisons et décrivons une nouvelle approche de dépistage in vitro (figure 1) pour identifier les sondes sensibles et spécifiques capables de discriminer entre l’activité nucléase en bonne santé et malsaine, ou l’activité spécifique à un type de cellule ou de bactéries. Profitant de la modularité des acides nucléiques, nous avons conçu une première bibliothèque de sondes oligonucléotides fluorescentes étanchées composées d’un ensemble complet de différentes séquences et chimies, les deux étant des paramètres importants pour la conception de la bibliothèque. Ces sondes d’oligonucléotide sont flanquées d’un fluorophore (fluorescein amidite, FAM) et d’un quencher (tide quencher 2, TQ2) aux 5′ et 3′ extrémités respectivement (tableau 1). En utilisant cet air fluorométrique basé sur le transfert d’énergie par résonance fluorescente (FRET) pour mesurer la cinétique de la dégradation enzymatique, nous avons pu identifier les sondes candidates ayant le potentiel de discriminer les modèles différentiels d’activité nucléane associés à des états sains ou malades. Nous avons conçu un processus itératif, dans lequel de nouvelles bibliothèques sont créées sur la base des meilleures sondes candidates, qui permet d’identifier des sondes candidates toujours plus spécifiques dans les étapes de dépistage ultérieures. De plus, cette approche tire parti de la nature catalytique des nucléases pour augmenter la sensibilité. Ceci est réalisé en tirant parti de la nature activatable des sondes de reporter et de la capacité des nucléases à traiter continuellement des molécules de substrat, représentant tous deux des avantages clés par rapport aux anticorps alternatifs ou aux méthodes de criblage à base de petites molécules.
Cette approche offre un outil de dépistage hautement modulaire, flexible et facile à mettre en œuvre pour l’identification de sondes d’acide nucléique spécifiques capables de discriminer entre les états sains et les états pathiques, et une excellente plate-forme pour le développement de nouveaux diagnostics qui peuvent être adaptés pour de futures applications cliniques. En tant que tel, cette approche a été utilisée pour identifier l’activité de nucléane dérivée de Salmonella Typhimurium (ci-dessus appelé Salmonella) pour l’identification spécifique de cette bactérie. Dans le protocole suivant, nous rendons compte d’une méthode pour dépister l’activité bactérienne de nucléase utilisant l’analyse cinétique.
Protocol
Representative Results
Discussion
Des modifications de l’activité nucléase ont été associées à une grande variété de phénotypes de la maladie, y compris différents types de cancer et d’infections bactériennes. Ces modifications sont proposées pour être l’agent causal d’une condition14, tandis que dans d’autres cas, elles sont la conséquence d’un événement physiologique préjudiciable20 ou agent pathogène16,26. Comme on pouvait s’y a…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs aimeraient remercier Luiza I. Hernandez (Université de Link-ping) pour sa révision minutieuse du manuscrit et ses précieux conseils. Ce travail a été soutenu par la Fondation Knut et Alice Wallenberg et le Swedish Government Strategic Research Area in Materials Science on Advanced Functional Materials de l’Université Link-ping (Faculty Grant SFO-Mat-LiU no 2009-00971).
Materials
| Black bottom, non-treated 96 well plate | Fisher Scientific | 10000631 | |
| Cytation1 | BioTek | CYT1FAV | |
| Eppendorf tubes | Thermofisher | 11926955 | |
| Escherichia coli | ATCC | 25922 | |
| Microbank cryogenic storage vial containing beads | Pro-Lab Diagnostics | 22-286-155 | |
| Nucleic acid probes | Biomers.net | # | |
| Phosphate Buffer Saline containing MgCl2 and CaCl2 | Gibco™ | 14040117 | |
| Salmonella enterica subs. Enterica | ATCC | 14028 | |
| Tris-EDTA | Fisher Scientific | 10647633 | |
| Tryptone Soya Agar with defibrinated sheep blood | Thermo Fisher Scientific | 10362223 | |
| Tryptic Soy Broth | Sigma Aldrich | 22092 |
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