Examen cinético de la actividad de nucleasa utilizando sondas de ácido nucleico
Summary
La actividad de nucleasa alterada se ha asociado con diferentes condiciones humanas, subyacentes a su potencial como biomarcador. La metodología de cribado modular y fácil de implementar presentada en este documento permite la selección de sondas específicas de ácido nucleico para aprovechar la actividad de nucleasa como biomarcador de enfermedades.
Abstract
Las nucleasas son una clase de enzimas que descomponen los ácidos nucleicos al catalizar la hidrólisis de los enlaces de fosfodiester que unen los azúcares ribosa. Las nucleasas muestran una variedad de funciones fisiológicas vitales en organismos procariotas y eucariotas, que van desde el mantenimiento de la estabilidad del genoma hasta la protección contra patógenos. La actividad de nucleasa alterada se ha asociado con varias condiciones patológicas, incluyendo infecciones bacterianas y cáncer. Con este fin, la actividad de nucleasas ha demostrado un gran potencial para ser explotada como un biomarcador específico. Sin embargo, un método de cribado robusto y reproducible basado en esta actividad sigue siendo altamente deseable.
En este documento, introducimos un método que permite el cribado de la actividad de nucleasa utilizando sondas de ácido nucleico como sustratos, con el alcance de la diferenciación entre condiciones patológicas y saludables. Este método ofrece la posibilidad de diseñar nuevas bibliotecas de sondeos, con una especificidad cada vez mayor, de forma iterativa. Por lo tanto, se realizan múltiples rondas de cribado para refinar el diseño de las sondas con características mejoradas, aprovechando la disponibilidad de ácidos nucleicos modificados químicamente. El considerable potencial de la tecnología propuesta reside en su flexibilidad, alta reproducibilidad y versatilidad para el cribado de la actividad de nucleasa asociada con las condiciones de la enfermedad. Se espera que esta tecnología permita el desarrollo de herramientas de diagnóstico prometedoras con un gran potencial en la clínica.
Introduction
Las nucleasas son una clase de enzimas capaces de cortar los enlaces de fosfodiester que forman la estructura columna vertebral de las moléculas de ácido nucleico. La gran diversidad de nucleasas hace que su clasificación sea bastante difícil. Sin embargo, existen algunos criterios comunes utilizados para describir las nucleasas, como la preferencia de sustrato (ácido desoxirribonucleico (ADN) o ácido ribonucleico (ARN)), el sitio de escote (endonucleasas o exonucleasas) o la dependencia de iones metálicos, entre otros1. Las nucleasas son enzimas catalíticas altamente conservadas que tienen funciones fundamentales en ambos organismos procariotas y eucariotas y se han utilizado, y siguen utilizándose, como herramientas de edición genética2. También son actores fundamentales en el mantenimiento y replicación del ADN, ayudando a mantener la estabilidad del genoma y participando en procesos de lectura de prueba3. En bacterias, por ejemplo, las nucleasas se han identificado como factores de virulencia importantes, capaces de promover la supervivencia bacteriana reduciendo la eficacia del sistema inmunitario del huésped4,5,6,7 ,8. En los mamíferos, se ha sugerido que las nucleasas están implicadas en la apoptosis9,la biogénesis mitocondrial y el mantenimiento10 y la mediación de las respuestas inmunitarias innatas antibacterianas y antivirales11. No es de extrañar que las alteraciones de la actividad de nucleasa, ya sea la mejora o la falta de, se hayan visto implicadas en una amplia gama de enfermedades humanas. Estas enfermedades van desde una amplia variedad de cánceres12,13 a hipertrofia cardíaca10 o enfermedades autoinmunes14. Por lo tanto, las nucleasas se han convertido en candidatos interesantes como biomarcadores para un grupo heterogéneo de condiciones humanas. De hecho, las nucleasas ya han demostrado su potencial como herramientas de diagnóstico exitosas para la detección de infecciones causadas por agentes bacterianos específicos, como Staphylococcus aureus o Escherichia coli15, 16. En muchos tipos de cáncer, la expresión de la proteína de nuleas estafilocócica 1 (SND1) ribonucleasa es indicativa de mal pronóstico17. En pacientes con cáncer de páncreas, se han notificado niveles séricos elevados de ribonucleasa I (RNase I)18 y se ha propuesto asociarse con fenotipos de células cancerosas19. En afecciones cardíacas isquémicas, como el infarto de miocardio o la angina pecírica inestable, los niveles séricos de desoxirrionucleasa I (DNase I) han demostrado ser un marcador diagnóstico válido20,21.
Se ha planteado la hipótesis de que el plan global de actividad de nucleasa puede ser diferente en estados sanos y de enfermedades. De hecho, informes recientes han utilizado diferencias en la actividad de nucleasa para distinguir entre fenotipos sanos y cancerosos22 o para identificar infecciones bacterianas patógenas de una manera específica de cada especie15,23. Estos hallazgos han abierto una nueva vía para el uso de nucleasas como biomarcadores de la enfermedad. Por lo tanto, existe la necesidad de que se elase un método de cribado integral que pueda identificar sistemáticamente las diferencias asociadas a la enfermedad en la actividad de nucleasa, que pueden ser de vital importancia en el desarrollo de nuevas herramientas de diagnóstico.
En este documento, presentamos y describimos un nuevo enfoque de cribado in vitro(Figura 1) para identificar sondas sensibles y específicas capaces de discriminar entre la actividad de nucleasa en sano y insalubre, o la actividad específica de un tipo de célula o bacteria. Aprovechando la modularidad de los ácidos nucleicos, diseñamos una biblioteca inicial de sondas de oligonucleótidos fluorescentes apantallados que consiste en un conjunto completo de diferentes secuencias y químicas, siendo ambos parámetros importantes para el diseño de la biblioteca. Estas sondas de oligonucleótidos están flanqueadas por un fluoróforo (fluoresceína amidita, FAM) y un quencher (tide quencher 2, TQ2) en los extremos de 5′ y 3′ respectivamente(Tabla 1). Mediante el uso de este ensayo fluorométrico basado en transferencia de energía por resonancia fluorescente (FRET) para medir la cinética de la degradación enzimática, pudimos identificar las sondas candidatas con el potencial de discriminar patrones diferenciales de actividad de nucleasa asociados con estados sanos o de enfermedad. Diseñamos un proceso iterativo, en el que se crean nuevas bibliotecas basadas en las mejores sondas candidatas, que permite la identificación de sondas candidatas cada vez más específicas en pasos de selección posteriores. Además, este enfoque aprovecha la naturaleza catalítica de las nucleasas para aumentar la sensibilidad. Esto se logra aprovechando la naturaleza activadezal de las sondas de reportero y la capacidad de las nucleasas para procesar continuamente moléculas de sustrato, ambas representando ventajas clave sobre anticuerpos alternativos o pequeños métodos de cribado basados en moléculas.
Este enfoque ofrece una herramienta de cribado altamente modular, flexible y fácil de implementar para la identificación de sondas específicas de ácido nucleico capaces de discriminar entre estados sanos y enfermedades, y una excelente plataforma para el desarrollo de nuevas herramientas de diagnóstico que se pueden adaptar para futuras aplicaciones clínicas. Como tal, este enfoque se utilizó para identificar la actividad de nucleasa derivada de Salmonella Typhimurium (en lo sucesivo, Salmonella)para la identificación específica de esta bacteria. En el siguiente protocolo, informamos sobre un método para detectar la actividad de nucleasas bacterianas mediante el análisis cinético.
Protocol
Representative Results
Discussion
Las alteraciones de la actividad de nucleasa se han asociado con una amplia variedad de fenotipos de la enfermedad, incluyendo diferentes tipos de cáncer e infecciones bacterianas. Se propone que estas alteraciones sean el agente causal de una condición14,mientras que en otros casos son consecuencia de un evento fisiológico perjudicial20 o agente patógeno16,26. No es de extrañar que se hayan descrito los intent…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores quisieran reconocer a Luiza I. Hernandez (Universidad de Link-ping) por su cuidadosa revisión del manuscrito y valiosos consejos. Este trabajo fue apoyado por la Fundación Knut y Alice Wallenberg y el área de investigación estratégica del gobierno sueco en ciencia de materiales sobre materiales funcionales avanzados en la Universidad de Link-ping (Faculty Grant SFO-Mat-LiU No. 2009-00971).
Materials
| Black bottom, non-treated 96 well plate | Fisher Scientific | 10000631 | |
| Cytation1 | BioTek | CYT1FAV | |
| Eppendorf tubes | Thermofisher | 11926955 | |
| Escherichia coli | ATCC | 25922 | |
| Microbank cryogenic storage vial containing beads | Pro-Lab Diagnostics | 22-286-155 | |
| Nucleic acid probes | Biomers.net | # | |
| Phosphate Buffer Saline containing MgCl2 and CaCl2 | Gibco™ | 14040117 | |
| Salmonella enterica subs. Enterica | ATCC | 14028 | |
| Tris-EDTA | Fisher Scientific | 10647633 | |
| Tryptone Soya Agar with defibrinated sheep blood | Thermo Fisher Scientific | 10362223 | |
| Tryptic Soy Broth | Sigma Aldrich | 22092 |
References
- Yang, W. Nucleases: diversity of structure, function and mechanism. Quarterly Reviews of Biophysics. 44 (1), 1-93 (2011).
- Adli, M. The CRISPR tool kit for genome editing and beyond. Nature Communication. 9 (1), 1911 (2018).
- Mason, P. A., Cox, L. S. The role of DNA exonucleases in protecting genome stability and their impact on ageing. Age (Dordr). 34 (6), 1317-1340 (2012).
- Berends, E. T., et al. Nuclease expression by Staphylococcus aureus facilitates escape from neutrophil extracellular traps. Journal of Innate Immunity. 2 (6), 576-586 (2010).
- Kiedrowski, M. R., et al. Staphylococcus aureus Nuc2 is a functional, surface-attached extracellular nuclease. PLoS One. 9 (4), 95574 (2014).
- Morita, C., et al. Cell wall-anchored nuclease of Streptococcus sanguinis contributes to escape from neutrophil extracellular trap-mediated bacteriocidal activity. PLoS One. 9 (8), 103125 (2014).
- Hasegawa, T., et al. Characterization of a virulence-associated and cell-wall-located DNase of Streptococcus pyogenes. Microbiology. 156, 184-190 (2010).
- Moon, A. F., et al. Structural insights into catalytic and substrate binding mechanisms of the strategic EndA nuclease from Streptococcus pneumoniae. Nucleic Acids Research. 39 (7), 2943-2953 (2011).
- Li, L. Y., Luo, X., Wang, X. Endonuclease G is an apoptotic DNase when released from mitochondria. Nature. 412 (6842), 95-99 (2001).
- McDermott-Roe, C., et al. Endonuclease G is a novel determinant of cardiac hypertrophy and mitochondrial function. Nature. 478 (7367), 114-118 (2011).
- Wang, Y. T., et al. A link between adipogenesis and innate immunity: RNase-L promotes 3T3-L1 adipogenesis by destabilizing Pref-1 mRNA. Cell Death & Disease. 7 (11), 2458 (2016).
- Li, C. L., Yang, W. Z., Shi, Z., Yuan, H. S. Tudor staphylococcal nuclease is a structure-specific ribonuclease that degrades RNA at unstructured regions during microRNA decay. RNA. 24 (5), 739-748 (2018).
- Wan, L., et al. MTDH-SND1 interaction is crucial for expansion and activity of tumor-initiating cells in diverse oncogene- and carcinogen-induced mammary tumors. Cancer Cell. 26 (1), 92-105 (2014).
- Keyel, P. A. Dnases in health and disease. Biologie du développement. 429 (1), 1-11 (2017).
- Hernandez, F. J., et al. Noninvasive imaging of Staphylococcus aureus infections with a nuclease-activated probe. Nature Medicine. 20 (3), 301-306 (2014).
- Flenker, K. S., et al. Rapid Detection of Urinary Tract Infections via Bacterial Nuclease Activity. Molecular Therapy. 25 (6), 1353-1362 (2017).
- Kannan, N., Eaves, C. J. Tipping the balance: MTDH-SND1 curbs oncogene-induced apoptosis and promotes tumorigenesis. Cell Stem Cell. 15 (2), 118-120 (2014).
- Kemmer, T. P., Malfertheiner, P., Buchler, M., Kemmer, M. L., Ditschuneit, H. Serum ribonuclease activity in the diagnosis of pancreatic disease. International Journal of Pancreatology. 8 (1), 23-33 (1991).
- Fernandez-Salas, E., Peracaula, R., Frazier, M. L., de Llorens, R. Ribonucleases expressed by human pancreatic adenocarcinoma cell lines. European Journal of Biochemistry. 267 (5), 1484-1494 (2000).
- Fujibayashi, K., et al. Serum deoxyribonuclease I activity can be a useful diagnostic marker for the early diagnosis of unstable angina pectoris or non-ST-segment elevation myocardial infarction. Journal of Cardiology. 59 (3), 258-265 (2012).
- Kawai, Y., et al. Diagnostic use of serum deoxyribonuclease I activity as a novel early-phase marker in acute myocardial infarction. Circulation. 109 (20), 2398-2400 (2004).
- Hernandez, L. I., Ozalp, V. C., Hernandez, F. J. Nuclease activity as a specific biomarker for breast cancer. Chemical Communication (Cambridge). 52 (83), 12346-12349 (2016).
- Machado, I., et al. Rapid and specific detection of Salmonella infections using chemically modified nucleic acid probes. Analytica Chimica Acta. 1054, 157-166 (2019).
- Sanders, E. R. Aseptic laboratory techniques: plating methods. Journal of Visualized Experiment. (63), e3064 (2012).
- Worthington Biochemical Corporation. . Manual of Clinical Enzyme Measurements. , (1972).
- Burghardt, E. L., et al. Rapid, Culture-Free Detection of Staphylococcus aureus Bacteremia. PLoS One. 11 (6), 0157234 (2016).
- Bibette, J. Gaining confidence in high-throughput screening. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 109 (3), 649-650 (2012).
- Hernandez, L. I., Machado, I., Schafer, T., Hernandez, F. J. Aptamers overview: selection, features and applications. Current Topics in Medicinal Chemistry. 15 (12), 1066-1081 (2015).
- Pande, J., Szewczyk, M. M., Grover, A. K. Phage display: concept, innovations, applications and future. Biotechnology Advances. 28 (6), 849-858 (2010).
- Skerra, A. Alternative binding proteins: anticalins – harnessing the structural plasticity of the lipocalin ligand pocket to engineer novel binding activities. FEBS Journal. 275 (11), 2677-2683 (2008).
- Ku, T. H., et al. Nucleic Acid Aptamers: An Emerging Tool for Biotechnology and Biomedical Sensing. Sensors (Basel). 15 (7), 16281-16313 (2015).
- Jayasena, S. D. Aptamers: an emerging class of molecules that rival antibodies in diagnostics. Clinical Chemistry. 45 (9), 1628-1650 (1999).
- Gray, B. P., Brown, K. C. Combinatorial peptide libraries: mining for cell-binding peptides. Chemical Reviews. 114 (2), 1020-1081 (2014).
