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Genetics

クロマチンドメインのノボ形成を研究する方法

Published: August 23, 2019
doi:
10.3791/60039
,
1Howard Hughes Medical Institute,New York University School of Medicine, 2Department of Biochemistry and Molecular Pharmacology,New York University School of Medicine, 3Whitehead Institute for Biomedical Research

Summary

この方法は、細胞株におけるPRC2媒介クロマチンドメインの形成に従うように設計されており、この方法は他の多くのシステムに適応することができる。

Abstract

クロマチンドメインの組織および構造は、個々の細胞系統に固有である。彼らの誤った規制は、細胞同一性および/または病気の損失につながる可能性があります。多大な努力にもかかわらず、クロマチンドメインの形成と伝播に関する我々の理解は依然として限られている。クロマチンドメインは、確立中の最初の事象に従うことを助長しない定常状態条件下で研究されている。ここでは、クロマチンドメインを誘導的に再構築し、時間の関数として再形成する方法を提示する。しかし、最初にPRC2媒介性抑圧クロマチンドメイン形成の場合に適用されるが、それは容易に他のクロマチンドメインに適応することができる。この方法をゲノミクスおよびイメージング技術と組み合わせることで、クロマチンドメインの確立を詳細に研究する貴重なツールが提供されます。この方法は、クロマチンドメインがどのように形成され、相互作用するかについての我々の理解に革命をもたらすと信じています。

Introduction

真核生物ゲノムは高度に組織化されており、クロマチンアクセシビリティの変化は遺伝子転写1を直接制御する。ゲノムには、転写活性および複製タイミング2、3と相関する異なるタイプのクロマチンドメインが含まれている。これらのクロマチンドメインのサイズは数キロベース(kb)から100kb以上の範囲であり、異なるヒストン修飾4の濃縮によって特徴付けられます。中心的な問題は、これらのドメインがどのように形成され、どのように伝播されるかということです。

最もよく特徴付けられたクロマチンドメインの1つは、ポリコム抑圧複合体2(PRC2)の活性を通じて促進される。PRC2は、タンパク質5、6のポリコムグループ(PcG)のサブセットで構成されるマルチサブユニット複合体であり、ヒストンH3(H3K27me1/me2/me3)7、8、リジン27のモノ、ディ、トリメチル化を触媒する。 9,10.H3K27me2/me3は抑圧的なクロマチン状態に関連しているが、H3K27me1の機能は不明6,11である。PRC2のコアコンポーネントの1つである胚性エクトダーム開発(EED)は、その芳香族ケージを介してPRC2触媒、H3K27me3の最終産物に結合し、この特徴はPRC212、13のアロステリック刺激をもたらす。PRC2酵素活性は、特定の系統に対して禁忌である特定の発達遺伝子の不適切な発現が有害であるとして、発達中に細胞同一性を維持するために重要である5,6.したがって、中国が哺乳類における抑圧的なクロマチンドメインの形成を促進するメカニズムを解明することは、細胞同一性を理解する上で根本的に重要である。

PRC2媒介クロマチンドメインを含むクロマチンドメイン形成を調査するように設計された過去の実験システムのすべては、クロマチンドメイン形成の展開イベントを追跡することができない定常状態条件下で行われた。細胞。ここでは、クロマチンドメインの初期募集と伝播を監視する誘導性細胞系を生成するための詳細なプロトコルを提示する。具体的には、H3K27me2/3を含むPRC2媒介性抑圧クロマチンドメインの形成を追跡することに焦点を当てる。クロマチンドメイン形成の機械的詳細を捕捉できるこのシステムは、H2AK119ubまたはH3K9meのいずれかを含む広く研究されたドメインのような他のクロマチンドメインを組み込むことに適合させることができる。ゲノミクスやイメージング技術と組み合わせることで、クロマチン生物学における様々な重要な問題にうまく対処する可能性があります。

Protocol

誘導性EEDレスキューMESCの生成 1. 細胞培養 4-ヒドロキシタモキシフェン(4-OHT)13の投与時に核に転移することができる安定に統合されたCreERT2トランスジーンを有するフィーダーフリーC57BL/6マウス胚性幹細胞(MESC)を使用する。 従来のESC培地14,15でMESCを成長させ、1000 U/mL LIF、1μM ERK阻害剤PD0325901および3μM GSK3阻害剤CHIR99021を補充し…

Representative Results

条件付き救助システムの一般的なスキーム図1は、内因性EED遺伝子座から発現されるWTまたはケージ変異体(Y365A)EEDを用いたEED KO細胞を条件付きで救出するターゲティングスキームを示す。その安定性と酵素活性に不可欠なPRC2のコアサブユニットであるEEDをノックアウトした後、EEDのエキソン9に続くイントロン内のカセットが導入される(図…

Discussion

特定のクロマチンドメインの形成中に機械的な詳細を理解するための強力なアプローチは、最初にドメインを破壊し、細胞内で進行中のその再構成を追跡することです。プロセスは、再構築中にいつでも一時停止して、進行中のイベントを詳細に分析できます。クロマチンドメインに関する以前の研究では、このような事象を解決することはできず、安定した状態下で行われました(例えば、…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

原稿の改訂に感謝します。D.R.ラボは、ハワードヒューズ医学研究所と国立衛生研究所(R01CA199652およびR01NS100897)によってサポートされています。

Materials

(Z)-4-Hydroxytamoxifen (5 mg) Sigma H7904-5MG For induction of EED expression
16% Paraformaldehyde aqueous solution (10×10 ml) Electron Microscopy Sciences 15710 For immunofluorescence
2-mercaptoethanol LifeTechnologies 21985-023 For mESCs culture
2% Gelatin Solution Sigma G1393-100ml For mESCs culture
Accutase 500 ML Innovative Cell Tech/FISHER AT 104-500 For mESCs culture
Alexa Fluor 594 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) Jackson immunoresaerch 711-585-152 For immunofluorescence
Aqua-Mount Mounting Medium FISHER/VWR 41799-008 For immunofluorescence
CHAMBER SLD TC PRMA 8-CHM 16 PK Fisher Sci 177445PK For immunofluorescence
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) – 10 mg Life Tech D1306 For immunofluorescence
ERK inhibitor, PD0325901 Stemgent 04-0006 For mESCs culture
ESGRO Recombinant Mouse LIF Protein Millipore/Fisher ESG1107 For mESCs culture
FBS Stem Cell Qualified Atlanta S10250 For mESCs culture
Gibson Assembly Master Mix NEB E2611L For Donor template cloning
GSK3 inhibitor, CHIR99021 Stemgent 04-0004 For mESCs culture
H3K27me2 (D18C8) rabbit mAB Cell Signaling 9728S Antibody for ChIP-seq
H3K27me3 Cell Signaling 9733S Antibody for ChIP-seq
Histone H2Av antibody (pAb) Active motif 39715 Spike-in control for ChIP-seq
Knockout DMEM Invitrogen 10829-018 For mESCs culture
L-glutamine Sigma G7513 For mESCs culture
Lipofectamine 2000 LifeTech 11668019 For transfection
MangoTaq DNA Polymerase Bioline BIO-21079 For Genotyping PCR
Normal donkey serum (10 mL) Jackson ImmunoResearch 017-000-121 For immunofluorescence
Penicillin-Streptomycin Sigma/Roche P0781 For mESCs culture
pSpCas9(BB)-2A-GFP (PX458) Addgene 48138 For gRNA cloning
QuickExtract DNA Extraction Solution Lucigen QE0905T For Genotyping PCR
Triton X-100 Sigma T8787-250ML
Zero Blunt PCR Cloning Kit Thermo Fisher K270020 For Donor template cloning
Primers/gBlocks
EED-KO-gRNA-1 Sequence: ctctggctactgtcaactag. gRNAs pairs to knockout EED in C57BL/6 ESCs for i-WT-r and i-MT-r systems.
EED-KO-gRNA-2 Sequence: TAGGCTATGACGCAGCTCAG. gRNAs pairs to knockout EED in C57BL/6 ESCs for i-WT-r and i-MT-r systems.
EED-gRNA-inducible Sequence: atggcaccccgaaattagaa. gRNA and Donor to generate i-WT-r system in the EED-KO background.
i-WT-r Donor https://benchling.com/s/seq-l2LLlWNEnLrfGXcbdCxI. gRNA and Donor to generate i-WT-r system in the EED-KO background.
EED-gRNA-inducible Sequence: atggcaccccgaaattagaa. gRNA and Donor to generate i-WT-r system in the EED-KO background.
i-MT-r Donor https://benchling.com/s/seq-n8eiZCB2XAkOuzzpv6qM. gRNA and Donor to generate i-MT-r system in the EED-KO background.
Genotyping Primers
Gnt-EED-KO-FW-1 Sequence: ctgtaggctgccatctgtga. Wild type allele will produce a product of 1.9 kb. Knockout allele will produce a product of 200 bp.
Gnt-EED-KO-REV-1 Sequence: agccagggctacacagagaa. Wild type allele will produce a product of 1.9 kb. Knockout allele will produce a product of 200 bp.
Inducible_Genotype-FW-1 Sequence: tgcagtgaaacaaatttggaa. When the casette is inserted, the primers will produce 1863 bp. The wild type allele will produce a product of ~200 bp.
Inducible_Genotype-REV-1 Sequence: gagaggggtggcactgtaaa. When the casette is inserted, the primers will produce 1863 bp. The wild type allele will produce a product of ~200 bp.
Inducible_Genotype-FW-2 Sequence: ccccctctttctccttttct. When the casette is inserted, the primers will produce 3200 bp. The wild type allele will produce a product of 1560 bp.
Inducible_Genotype-REV-2 Sequence: atgcctgggtgaatgaaaaa. When the casette is inserted, the primers will produce 3200 bp. The wild type allele will produce a product of 1560 bp.
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References

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Oksuz, O., Reinberg, D. A Method to Study de novo Formation of Chromatin Domains. J. Vis. Exp. (150), e60039, doi:10.3791/60039 (2019).
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