Une méthode d'étude de novo Formation des Domaines chromatine
Summary
Cette méthode est conçue pour suivre la formation de domaines de chromatine à médiation PRC2 dans les lignées cellulaires, et la méthode peut être adaptée à de nombreux autres systèmes.
Abstract
L’organisation et la structure des domaines de chromatine sont uniques aux lignées cellulaires individuelles. Leur mauvaise réglementation pourrait entraîner une perte de l’identité cellulaire et/ou de la maladie. Malgré d’énormes efforts, notre compréhension de la formation et de la propagation des domaines de la chromatine est encore limitée. Les domaines de chromatine ont été étudiés dans des conditions d’état stable, qui ne sont pas propices à suivre les événements initiaux pendant leur établissement. Ici, nous présentons une méthode pour reconstruire inducibly les domaines de chromatine et suivre leur reformation en fonction du temps. Bien que, d’abord appliqué au cas de la formation de domaine de chromatine répressive à médiation PRC2, il pourrait être facilement adapté à d’autres domaines de chromatine. La modification et/ou la combinaison de cette méthode avec la génomique et les technologies d’imagerie fournira des outils précieux pour étudier en détail l’établissement des domaines de la chromatine. Nous croyons que cette méthode va révolutionner notre compréhension de la façon dont les domaines de chromatine se forment et interagissent les uns avec les autres.
Introduction
Les génomes eucaryotes sont très organisés et les changements dans l’accessibilité de la chromatine contrôlent directement la transcription des gènes1. Le génome contient des types distincts de domaines de chromatine, qui sont en corrélation avec l’activité transcriptionnelle et le calendrier de réplication2,3. Ces domaines de chromatine varient en taille de quelques kilobases (kb) à plus de 100 kb et sont caractérisés par un enrichissement dans les modifications histone s’agit de distincts4. Les questions centrales sont les suivantes : comment ces domaines sont-ils formés et comment se propagent-ils ?
L’un des domaines de chromatine les plus bien caractérisés est favorisé par l’activité du complexe répressif Polycomb 2 (PRC2). PRC2 est un complexe multi-subunit composé d’un sous-ensemble du Groupe Polycomb (PcG) de protéines5,6, et catalyse le mono-, di- et trimethylation de lysine 27 de l’histone H3 (H3K27me1/me2/me3)7,8, 9,10. H3K27me2/me3 sont associés à un état de chromatine répressif, mais la fonction de H3K27me1 n’est pas claire6,11. L’un des composants de base de PRC2, le développement embryonnaire ectoderm (EED), se lie au produit final de la catalyse PRC2, H3K27me3, à travers sa cage aromatique et cette caractéristique se traduit par la stimulation allostérique de PRC212,13. L’activité enzymatique PRC2 est cruciale pour préserver l’identité cellulaire pendant le développement car l’expression inappropriée de certains gènes développementaux qui sont contre-indiqués pour une lignée spécifique, serait préjudiciable5,6 . Par conséquent, démêler les mécanismes par lesquels PRC2 favorise la formation de domaines répressifs de chromatine chez les mammifères est d’une importance fondamentale pour comprendre l’identité cellulaire.
Tous les systèmes expérimentaux antérieurs conçus pour étudier la formation de domaine de chromatine, y compris les domaines de chromatine à médiation PRC2, ont été exécutés dans des conditions d’état stable, qui sont incapables de suivre les événements qui se déroulent de la formation de domaine de chromatine dans Cellules. Ici, nous présentons un protocole détaillé pour générer un système cellulaire inductible qui surveille le recrutement initial et la propagation des domaines de chromatine. Plus précisément, nous nous concentrons sur le suivi de la formation de domaines de chromatine répressive à médiation PRC2 qui comprennent H3K27me2/3. Ce système qui peut capturer les détails mécanistes de la formation de domaine de chromatine, pourrait être adapté pour intégrer d’autres domaines de chromatine, tels que les domaines largement étudiés comprenant soit H2AK119ub ou H3K9me. Combinée à la génomique et aux technologies d’imagerie, cette approche a le potentiel de répondre avec succès à diverses questions clés en biologie de la chromatine.
Protocol
Representative Results
Discussion
Une approche puissante pour comprendre les détails mécanistes lors de la formation d’un domaine de chromatine donnée, est d’abord perturber le domaine, puis suivre sa reconstruction en cours au sein des cellules. Le processus peut être interrompu à tout moment pendant la reconstruction pour analyser en détail les événements en cours. Les études antérieures sur les domaines de chromatine n’ont pas été en mesure de résoudre de tels événements car ils ont été effectués dans des conditions d’état stable (p…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions les Drs L. Vales, D. Ozata et H. Mou pour la révision du manuscrit. Le Laboratoire D.R. est soutenu par le Howard Hughes Medical Institute et les National Institutes of Health (R01CA199652 et R01NS100897).
Materials
| (Z)-4-Hydroxytamoxifen (5 mg) | Sigma | H7904-5MG | For induction of EED expression |
| 16% Paraformaldehyde aqueous solution (10×10 ml) | Electron Microscopy Sciences | 15710 | For immunofluorescence |
| 2-mercaptoethanol | LifeTechnologies | 21985-023 | For mESCs culture |
| 2% Gelatin Solution | Sigma | G1393-100ml | For mESCs culture |
| Accutase 500 ML | Innovative Cell Tech/FISHER | AT 104-500 | For mESCs culture |
| Alexa Fluor 594 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson immunoresaerch | 711-585-152 | For immunofluorescence |
| Aqua-Mount Mounting Medium | FISHER/VWR | 41799-008 | For immunofluorescence |
| CHAMBER SLD TC PRMA 8-CHM 16 PK | Fisher Sci | 177445PK | For immunofluorescence |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) – 10 mg | Life Tech | D1306 | For immunofluorescence |
| ERK inhibitor, PD0325901 | Stemgent | 04-0006 | For mESCs culture |
| ESGRO Recombinant Mouse LIF Protein | Millipore/Fisher | ESG1107 | For mESCs culture |
| FBS Stem Cell Qualified | Atlanta | S10250 | For mESCs culture |
| Gibson Assembly Master Mix | NEB | E2611L | For Donor template cloning |
| GSK3 inhibitor, CHIR99021 | Stemgent | 04-0004 | For mESCs culture |
| H3K27me2 (D18C8) rabbit mAB | Cell Signaling | 9728S | Antibody for ChIP-seq |
| H3K27me3 | Cell Signaling | 9733S | Antibody for ChIP-seq |
| Histone H2Av antibody (pAb) | Active motif | 39715 | Spike-in control for ChIP-seq |
| Knockout DMEM | Invitrogen | 10829-018 | For mESCs culture |
| L-glutamine | Sigma | G7513 | For mESCs culture |
| Lipofectamine 2000 | LifeTech | 11668019 | For transfection |
| MangoTaq DNA Polymerase | Bioline | BIO-21079 | For Genotyping PCR |
| Normal donkey serum (10 mL) | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | For immunofluorescence |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma/Roche | P0781 | For mESCs culture |
| pSpCas9(BB)-2A-GFP (PX458) | Addgene | 48138 | For gRNA cloning |
| QuickExtract DNA Extraction Solution | Lucigen | QE0905T | For Genotyping PCR |
| Triton X-100 | Sigma | T8787-250ML | |
| Zero Blunt PCR Cloning Kit | Thermo Fisher | K270020 | For Donor template cloning |
| Primers/gBlocks | |||
| EED-KO-gRNA-1 | Sequence: ctctggctactgtcaactag. gRNAs pairs to knockout EED in C57BL/6 ESCs for i-WT-r and i-MT-r systems. | ||
| EED-KO-gRNA-2 | Sequence: TAGGCTATGACGCAGCTCAG. gRNAs pairs to knockout EED in C57BL/6 ESCs for i-WT-r and i-MT-r systems. | ||
| EED-gRNA-inducible | Sequence: atggcaccccgaaattagaa. gRNA and Donor to generate i-WT-r system in the EED-KO background. | ||
| i-WT-r Donor | https://benchling.com/s/seq-l2LLlWNEnLrfGXcbdCxI. gRNA and Donor to generate i-WT-r system in the EED-KO background. | ||
| EED-gRNA-inducible | Sequence: atggcaccccgaaattagaa. gRNA and Donor to generate i-WT-r system in the EED-KO background. | ||
| i-MT-r Donor | https://benchling.com/s/seq-n8eiZCB2XAkOuzzpv6qM. gRNA and Donor to generate i-MT-r system in the EED-KO background. | ||
| Genotyping Primers | |||
| Gnt-EED-KO-FW-1 | Sequence: ctgtaggctgccatctgtga. Wild type allele will produce a product of 1.9 kb. Knockout allele will produce a product of 200 bp. | ||
| Gnt-EED-KO-REV-1 | Sequence: agccagggctacacagagaa. Wild type allele will produce a product of 1.9 kb. Knockout allele will produce a product of 200 bp. | ||
| Inducible_Genotype-FW-1 | Sequence: tgcagtgaaacaaatttggaa. When the casette is inserted, the primers will produce 1863 bp. The wild type allele will produce a product of ~200 bp. | ||
| Inducible_Genotype-REV-1 | Sequence: gagaggggtggcactgtaaa. When the casette is inserted, the primers will produce 1863 bp. The wild type allele will produce a product of ~200 bp. | ||
| Inducible_Genotype-FW-2 | Sequence: ccccctctttctccttttct. When the casette is inserted, the primers will produce 3200 bp. The wild type allele will produce a product of 1560 bp. | ||
| Inducible_Genotype-REV-2 | Sequence: atgcctgggtgaatgaaaaa. When the casette is inserted, the primers will produce 3200 bp. The wild type allele will produce a product of 1560 bp. |
References
- Bonev, B., Cavalli, G. Organization and function of the 3D genome. Nature Reviews Genetics. 17 (11), 661-678 (2016).
- Dixon, J. R., et al. Topological domains in mammalian genomes identified by analysis of chromatin interactions. Nature. 485 (7398), 376-380 (2012).
- Pope, B. D., et al. Topologically associating domains are stable units of replication-timing regulation. Nature. 515 (7527), 402-405 (2014).
- Carelli, F. N., Sharma, G., Broad Ahringer, J. Chromatin Domains: An Important Facet of Genome Regulation. Bioessays. 39 (12), (2017).
- Margueron, R., Reinberg, D. The Polycomb complex PRC2 and its mark in life. Nature. 469 (7330), 343-349 (2011).
- Holoch, D., Margueron, R. Mechanisms Regulating PRC2 Recruitment and Enzymatic Activity. Trends in Biochemical Sciences. 42 (7), 531-542 (2017).
- Cao, R., et al. Role of histone H3 lysine 27 methylation in polycomb-group silencing. Science. 298 (5595), 1039-1043 (2002).
- Kuzmichev, A., Nishioka, K., Erdjument-Bromage, H., Tempst, P., Reinberg, D. Histone methyltransferase activity associated with a human multiprotein complex containing the enhancer of zeste protein. Genes and Development. 16 (22), 2893-2905 (2002).
- Czermin, B., Melfi, R., McCabe, D., Seitz, V., Imhof, A., Pirrotta, V. Drosophila enhancer of Zeste/ESC complexes have a histone H3 methyltransferase activity that marks chromosomal Polycomb sites. Cell. 111 (2), 185-196 (2002).
- Müller, J., et al. Histone methyltransferase activity of a Drosophila Polycomb group repressor complex. Cell. 111 (2), 197-208 (2002).
- Ferrari, K. J., et al. Polycomb-Dependent H3K27me1 and H3K27me2 Regulate Active Transcription and Enhancer Fidelity. Molecular Cell. 53 (1), 49-62 (2014).
- Margueron, R., et al. Role of the polycomb protein EED in the propagation of repressive histone marks. Nature. 461 (7265), 762-767 (2009).
- Oksuz, O., et al. Capturing the Onset of PRC2-Mediated Repressive Domain Formation. Molecular cell. 70 (6), 1149-1162 (2018).
- Tee, W. W., Shen, S. S., Oksuz, O., Narendra, V., Reinberg, D. Erk1/2 activity promotes chromatin features and RNAPII phosphorylation at developmental promoters in mouse ESCs. Cell. 156 (4), 678-690 (2014).
- Oksuz, O., Tee, W. W. Probing chromatin modifications in response to ERK signaling. Methods in Molecular Biology. 1487, 289-301 (2017).
- Benchling for Academics. Benchling Available from: https://benchling.com (2018)
- Ran, F. A., Hsu, P. D., Wright, J., Agarwala, V., Scott, D. A., Zhang, F. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).
- Zhang, Z., Lutz, B. Cre recombinase-mediated inversion using lox66 and lox71: method to introduce conditional point mutations into the CREB-binding protein. Nucleic acids research. 30 (17), 90 (2002).
- Orlando, D. A., et al. Quantitative ChIP-Seq normalization reveals global modulation of the epigenome. Cell reports. 9 (3), 1163-1170 (2014).
- Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nature Methods. 9 (4), 357-359 (2012).
- Descostes, N. ChIPSeqSpike: ChIP-Seq data scaling according to spike-in control. R package version 1.2.1. , (2019).
- Quinlan, A. R., Hall, I. M. BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features. Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).
- Kent, W. J., Zweig, A. S., Barber, G., Hinrichs, A. S., Karolchik, D. BigWig and BigBed: enabling browsing of large distributed datasets. Bioinformatics. 26 (17), 2204-2207 (2010).
- . UCSC Genome Browser Home Available from: https://genome.ucsc.edu (2019)
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Nishimura, K., Fukagawa, T., Takisawa, H., Kakimoto, T., Kanemaki, M. An auxin-based degron system for the rapid depletion of proteins in nonplant cells. Nature Methods. 6 (12), 917-922 (2009).
- Banaszynski, L. A., Chen, L., Maynard-Smith, L. A., Ooi, A. G. L., Wandless, T. J. A Rapid, Reversible, and Tunable Method to Regulate Protein Function in Living Cells Using Synthetic Small Molecules. Cell. 126 (5), 995-1004 (2006).
- Højfeldt, J. W., et al. Accurate H3K27 methylation can be established de novo by SUZ12-directed PRC2. Nature Structural & Molecular Biology. 25 (3), 225-232 (2018).
