En metode til at studere de Novo dannelse af kromatin domæner
Summary
Denne metode er designet til at følge dannelsen af PRC2-mediated kromatin domæner i cellelinjer, og metoden kan tilpasses til mange andre systemer.
Abstract
Organisation og struktur af kromatin domæner er unikke for individuelle celle lineages. Deres fejl regulering kan føre til et tab af cellulær identitet og/eller sygdom. På trods af en enorm indsats, er vores forståelse af dannelsen og udbredelsen af kromatin domæner stadig begrænset. Kromatin domæner er blevet undersøgt under Steady-State betingelser, som ikke er befordrende for at følge de første begivenheder under deres etablering. Her præsenterer vi en metode til inducibly rekonstruere kromatin domæner og følge deres re-formation som en funktion af tid. Selv om, først anvendes på tilfælde af PRC2-medieret undertrykkende kromatin domæne dannelse, det kunne nemt tilpasses andre kromatin domæner. Ændringen af og/eller kombinationen af denne metode med genomforskning og billeddannelsesteknologier vil give uvurderlige værktøjer til at studere etableringen af kromatin domæner i stor detalje. Vi mener, at denne metode vil revolutionere vores forståelse af, hvordan kromatin domæner form og interagere med hinanden.
Introduction
Eukaryotic genomer er meget organiseret og ændringer i kromatin tilgængelighed direkte kontrollerer gen transkriptionen1. Genomet indeholder forskellige typer af kromatin domæner, som korrelerer med transkriptional aktivitet og replikation timing2,3. Disse kromatin domæner spænder i størrelse fra et par kilobaser (KB) til mere end 100 KB og er karakteriseret ved en berigelse i særskilte Histon modifikationer4. De centrale spørgsmål er: hvordan dannes disse domæner, og hvordan spredes de?
En af de mest velkarakteriserede kromatin domæner fremmes gennem aktiviteten af Polycomb repressive kompleks 2 (PRC2). PRC2 er en multi-subunit kompleks bestående af en delmængde af polycomb gruppe (PCG) af proteiner5,6, og katalyserer mono-, di-og trimethylering af lysin 27 af Histon H3 (H3K27me1/ME2/me3)7,8, 9,10. H3K27me2/me3 er forbundet med en undertrykkende kromatin tilstand, men funktionen af H3K27me1 er uklar6,11. En af de centrale komponenter i PRC2, embryonale ectoderm udvikling (Eed), binder til slutproduktet af PRC2 katalyse, H3K27me3, gennem sin aromatiske bur og denne funktion resulterer i allosteriske stimulation af PRC212,13. Den PRC2 enzymatiske aktivitet er afgørende for at bevare cellernes identitet under udviklingen, da det uhensigtsmæssige udtryk for visse udviklingsmæssige gener, der er kontraindiceret for en bestemt slægt, ville være skadeligt5,6 . Derfor, unraveling de mekanismer, som PRC2 fremmer dannelsen af repressive kromatin domæner i pattedyr er af grundlæggende betydning for forståelsen cellulære identitet.
Alle de tidligere eksperimentelle systemer designet til at undersøge kromatin domæne dannelse herunder PRC2-medierede kromatin domæner, blev udført under Steady-State betingelser, som ikke er i stand til at spore de udfolder hændelser af kromatin domæne dannelse i Celler. Her præsenterer vi en detaljeret protokol til at generere en inducerbar cellulære system, der overvåger den indledende rekruttering og formering af kromatin domæner. Specifikt fokuserer vi på at spore dannelsen af PRC2-medierede repressive kromatin domæner, der omfatter H3K27me2/3. Dette system, der kan fange de mekanistiske detaljer af kromatin domæne dannelse, kunne tilpasses til at indarbejde andre kromatin domæner, såsom de bredt undersøgt domæner, der omfatter enten H2AK119ub eller H3K9me. I kombination med genomforskning og billeddannelsesteknologier har denne tilgang potentialet til at kunne håndtere forskellige, centrale spørgsmål i kromatin biologi.
Protocol
Representative Results
Discussion
En kraftfuld tilgang til at forstå de mekaniske detaljer under dannelsen af et givent kromatin domæne, er først at forstyrre domænet og derefter spore sin genopbygning i gang i cellerne. Processen kan afbrydes på ethvert tidspunkt under genopbygningen for at analysere i detaljer de begivenheder, der er i gang. Tidligere undersøgelser af kromatin domæner kunne ikke løse sådanne hændelser, da de blev udført under Steady-State betingelser (f. eks. sammenligne Wild-type og gen knockout). Her skitserer vi et system…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker DRs. L. Vales, D. Ozata og H. MOU for revision af manuskriptet. D.R. Lab er støttet af Howard Hughes Medical Institute og National Institutes of Health (R01CA199652 og R01NS100897).
Materials
| (Z)-4-Hydroxytamoxifen (5 mg) | Sigma | H7904-5MG | For induction of EED expression |
| 16% Paraformaldehyde aqueous solution (10×10 ml) | Electron Microscopy Sciences | 15710 | For immunofluorescence |
| 2-mercaptoethanol | LifeTechnologies | 21985-023 | For mESCs culture |
| 2% Gelatin Solution | Sigma | G1393-100ml | For mESCs culture |
| Accutase 500 ML | Innovative Cell Tech/FISHER | AT 104-500 | For mESCs culture |
| Alexa Fluor 594 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson immunoresaerch | 711-585-152 | For immunofluorescence |
| Aqua-Mount Mounting Medium | FISHER/VWR | 41799-008 | For immunofluorescence |
| CHAMBER SLD TC PRMA 8-CHM 16 PK | Fisher Sci | 177445PK | For immunofluorescence |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) – 10 mg | Life Tech | D1306 | For immunofluorescence |
| ERK inhibitor, PD0325901 | Stemgent | 04-0006 | For mESCs culture |
| ESGRO Recombinant Mouse LIF Protein | Millipore/Fisher | ESG1107 | For mESCs culture |
| FBS Stem Cell Qualified | Atlanta | S10250 | For mESCs culture |
| Gibson Assembly Master Mix | NEB | E2611L | For Donor template cloning |
| GSK3 inhibitor, CHIR99021 | Stemgent | 04-0004 | For mESCs culture |
| H3K27me2 (D18C8) rabbit mAB | Cell Signaling | 9728S | Antibody for ChIP-seq |
| H3K27me3 | Cell Signaling | 9733S | Antibody for ChIP-seq |
| Histone H2Av antibody (pAb) | Active motif | 39715 | Spike-in control for ChIP-seq |
| Knockout DMEM | Invitrogen | 10829-018 | For mESCs culture |
| L-glutamine | Sigma | G7513 | For mESCs culture |
| Lipofectamine 2000 | LifeTech | 11668019 | For transfection |
| MangoTaq DNA Polymerase | Bioline | BIO-21079 | For Genotyping PCR |
| Normal donkey serum (10 mL) | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | For immunofluorescence |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma/Roche | P0781 | For mESCs culture |
| pSpCas9(BB)-2A-GFP (PX458) | Addgene | 48138 | For gRNA cloning |
| QuickExtract DNA Extraction Solution | Lucigen | QE0905T | For Genotyping PCR |
| Triton X-100 | Sigma | T8787-250ML | |
| Zero Blunt PCR Cloning Kit | Thermo Fisher | K270020 | For Donor template cloning |
| Primers/gBlocks | |||
| EED-KO-gRNA-1 | Sequence: ctctggctactgtcaactag. gRNAs pairs to knockout EED in C57BL/6 ESCs for i-WT-r and i-MT-r systems. | ||
| EED-KO-gRNA-2 | Sequence: TAGGCTATGACGCAGCTCAG. gRNAs pairs to knockout EED in C57BL/6 ESCs for i-WT-r and i-MT-r systems. | ||
| EED-gRNA-inducible | Sequence: atggcaccccgaaattagaa. gRNA and Donor to generate i-WT-r system in the EED-KO background. | ||
| i-WT-r Donor | https://benchling.com/s/seq-l2LLlWNEnLrfGXcbdCxI. gRNA and Donor to generate i-WT-r system in the EED-KO background. | ||
| EED-gRNA-inducible | Sequence: atggcaccccgaaattagaa. gRNA and Donor to generate i-WT-r system in the EED-KO background. | ||
| i-MT-r Donor | https://benchling.com/s/seq-n8eiZCB2XAkOuzzpv6qM. gRNA and Donor to generate i-MT-r system in the EED-KO background. | ||
| Genotyping Primers | |||
| Gnt-EED-KO-FW-1 | Sequence: ctgtaggctgccatctgtga. Wild type allele will produce a product of 1.9 kb. Knockout allele will produce a product of 200 bp. | ||
| Gnt-EED-KO-REV-1 | Sequence: agccagggctacacagagaa. Wild type allele will produce a product of 1.9 kb. Knockout allele will produce a product of 200 bp. | ||
| Inducible_Genotype-FW-1 | Sequence: tgcagtgaaacaaatttggaa. When the casette is inserted, the primers will produce 1863 bp. The wild type allele will produce a product of ~200 bp. | ||
| Inducible_Genotype-REV-1 | Sequence: gagaggggtggcactgtaaa. When the casette is inserted, the primers will produce 1863 bp. The wild type allele will produce a product of ~200 bp. | ||
| Inducible_Genotype-FW-2 | Sequence: ccccctctttctccttttct. When the casette is inserted, the primers will produce 3200 bp. The wild type allele will produce a product of 1560 bp. | ||
| Inducible_Genotype-REV-2 | Sequence: atgcctgggtgaatgaaaaa. When the casette is inserted, the primers will produce 3200 bp. The wild type allele will produce a product of 1560 bp. |
References
- Bonev, B., Cavalli, G. Organization and function of the 3D genome. Nature Reviews Genetics. 17 (11), 661-678 (2016).
- Dixon, J. R., et al. Topological domains in mammalian genomes identified by analysis of chromatin interactions. Nature. 485 (7398), 376-380 (2012).
- Pope, B. D., et al. Topologically associating domains are stable units of replication-timing regulation. Nature. 515 (7527), 402-405 (2014).
- Carelli, F. N., Sharma, G., Broad Ahringer, J. Chromatin Domains: An Important Facet of Genome Regulation. Bioessays. 39 (12), (2017).
- Margueron, R., Reinberg, D. The Polycomb complex PRC2 and its mark in life. Nature. 469 (7330), 343-349 (2011).
- Holoch, D., Margueron, R. Mechanisms Regulating PRC2 Recruitment and Enzymatic Activity. Trends in Biochemical Sciences. 42 (7), 531-542 (2017).
- Cao, R., et al. Role of histone H3 lysine 27 methylation in polycomb-group silencing. Science. 298 (5595), 1039-1043 (2002).
- Kuzmichev, A., Nishioka, K., Erdjument-Bromage, H., Tempst, P., Reinberg, D. Histone methyltransferase activity associated with a human multiprotein complex containing the enhancer of zeste protein. Genes and Development. 16 (22), 2893-2905 (2002).
- Czermin, B., Melfi, R., McCabe, D., Seitz, V., Imhof, A., Pirrotta, V. Drosophila enhancer of Zeste/ESC complexes have a histone H3 methyltransferase activity that marks chromosomal Polycomb sites. Cell. 111 (2), 185-196 (2002).
- Müller, J., et al. Histone methyltransferase activity of a Drosophila Polycomb group repressor complex. Cell. 111 (2), 197-208 (2002).
- Ferrari, K. J., et al. Polycomb-Dependent H3K27me1 and H3K27me2 Regulate Active Transcription and Enhancer Fidelity. Molecular Cell. 53 (1), 49-62 (2014).
- Margueron, R., et al. Role of the polycomb protein EED in the propagation of repressive histone marks. Nature. 461 (7265), 762-767 (2009).
- Oksuz, O., et al. Capturing the Onset of PRC2-Mediated Repressive Domain Formation. Molecular cell. 70 (6), 1149-1162 (2018).
- Tee, W. W., Shen, S. S., Oksuz, O., Narendra, V., Reinberg, D. Erk1/2 activity promotes chromatin features and RNAPII phosphorylation at developmental promoters in mouse ESCs. Cell. 156 (4), 678-690 (2014).
- Oksuz, O., Tee, W. W. Probing chromatin modifications in response to ERK signaling. Methods in Molecular Biology. 1487, 289-301 (2017).
- Benchling for Academics. Benchling Available from: https://benchling.com (2018)
- Ran, F. A., Hsu, P. D., Wright, J., Agarwala, V., Scott, D. A., Zhang, F. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).
- Zhang, Z., Lutz, B. Cre recombinase-mediated inversion using lox66 and lox71: method to introduce conditional point mutations into the CREB-binding protein. Nucleic acids research. 30 (17), 90 (2002).
- Orlando, D. A., et al. Quantitative ChIP-Seq normalization reveals global modulation of the epigenome. Cell reports. 9 (3), 1163-1170 (2014).
- Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nature Methods. 9 (4), 357-359 (2012).
- Descostes, N. ChIPSeqSpike: ChIP-Seq data scaling according to spike-in control. R package version 1.2.1. , (2019).
- Quinlan, A. R., Hall, I. M. BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features. Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).
- Kent, W. J., Zweig, A. S., Barber, G., Hinrichs, A. S., Karolchik, D. BigWig and BigBed: enabling browsing of large distributed datasets. Bioinformatics. 26 (17), 2204-2207 (2010).
- . UCSC Genome Browser Home Available from: https://genome.ucsc.edu (2019)
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Nishimura, K., Fukagawa, T., Takisawa, H., Kakimoto, T., Kanemaki, M. An auxin-based degron system for the rapid depletion of proteins in nonplant cells. Nature Methods. 6 (12), 917-922 (2009).
- Banaszynski, L. A., Chen, L., Maynard-Smith, L. A., Ooi, A. G. L., Wandless, T. J. A Rapid, Reversible, and Tunable Method to Regulate Protein Function in Living Cells Using Synthetic Small Molecules. Cell. 126 (5), 995-1004 (2006).
- Højfeldt, J. W., et al. Accurate H3K27 methylation can be established de novo by SUZ12-directed PRC2. Nature Structural & Molecular Biology. 25 (3), 225-232 (2018).
