क्रोमैटिन डोमेन के नवो के गठन का अध्ययन करने की एक विधि
Summary
इस विधि को सेल लाइनों में PRC2-मध्यस्थ क्रोमैटिन डोमेन के गठन का पालन करने के लिए डिज़ाइन किया गया है, और विधि कई अन्य प्रणालियों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।
Abstract
संगठन और क्रोमैटिन डोमेन की संरचना व्यक्तिगत सेल वंश के लिए अद्वितीय हैं. उनके गलत विनियमन सेलुलर पहचान और / जबरदस्त प्रयासों के बावजूद, क्रोमैटिन डोमेन के गठन और प्रचार के बारे में हमारी समझ अभी भी सीमित है। क्रोमैटिन डोमेन का अध्ययन स्थिर राज्य स्थितियों के तहत किया गया है, जो अपनी स्थापना के दौरान प्रारंभिक घटनाओं का पालन करने के लिए अनुकूल नहीं हैं। यहाँ, हम क्रोमैटिन डोमेन को अनिवार्य रूप से पुनर्निर्माण करने और समय के एक समारोह के रूप में उनके पुन: गठन का पालन करने के लिए एक विधि प्रस्तुत करते हैं। हालांकि, पहले PRC2-मध्यस्थ दमनकारी क्रोमैटिन डोमेन गठन के मामले में लागू किया, यह आसानी से अन्य क्रोमैटिन डोमेन के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। जीनोमिक्स और इमेजिंग प्रौद्योगिकियों के साथ इस विधि के संशोधन और/या संयोजन महान विस्तार में क्रोमैटिन डोमेन की स्थापना का अध्ययन करने के लिए अमूल्य उपकरण प्रदान करेगा। हमें विश्वास है कि इस विधि कैसे chromatin डोमेन फार्म और एक दूसरे के साथ बातचीत की हमारी समझ में क्रांतिकारी बदलाव होगा.
Introduction
यूकैरियोटिक जीनोम अत्यधिक संगठित होते हैं और क्रोमैटिन पहुंच में परिवर्तन सीधे जीन प्रतिलेखन1को नियंत्रित करता है . जीनोम में क्रोमैटिन डोमेन के अलग-अलग प्रकार होते हैं, जो ट्रांसक्रिप्शनल गतिविधि और प्रतिकृति समय2,3के साथ सहसंबंधित होते हैं। इन क्रोमैटिन डोमेन का आकार कुछ किलोबेस (केबी) से लेकर 100 केबी तक होता है और इसकी विशेषता अलग-अलग हिस्टोन संशोधनों4में एक समृद्धि की विशेषता होती है। केंद्रीय प्रश्न हैं: इन डोमेन कैसे बनते हैं और उनका प्रचार कैसे किया जाता है?
सबसे अच्छी तरह से विशेषता क्रोमैटिन डोमेन में से एक Polycomb दमनकारी परिसर 2 (PRC2) की गतिविधि के माध्यम से बढ़ावा दिया है. पीआरसी 2 एक बहु-सबयूनिट जटिल है जो पॉलीकॉम्ब समूह (पीसीजी) के सबसेट से बना हैजिसमें प्रोटीन5,6, और मोनो-, डाइ-और ट्राइमेथिलेशन ऑफ हिस्टोन एच 3 (H3K27me1/ 9,10. H3K27me2/me3 एक दमनकारी क्रोमैटिन राज्य के साथ जुड़े रहे हैं, लेकिन H3K27me1 का कार्य स्पष्ट नहीं है6,11. पीआरसी 2 के मुख्य घटकों में से एक, भ्रूण बहिर्चर्म विकास (ईईडी), PRC2 catalysis, H3K27me3 के अंत उत्पाद के लिए बांध, अपने खुशबूदार पिंजरे के माध्यम से और इस सुविधा के परिणाम में PRC212,13के allosteric उत्तेजना . पीआरसी 2 एंजाइमी गतिविधि विकास के दौरान सेलुलर पहचान के संरक्षण के लिए महत्वपूर्ण है क्योंकि कुछ विकासात्मक जीनों की अनुचित अभिव्यक्ति जो किसी विशिष्ट वंश के लिएनिषिद्धहैं, 5,6 . इसलिए, तंत्र जिसके द्वारा PRC2 स्तनधारियों में दमनकारी क्रोमैटिन डोमेन के गठन को बढ़ावा जानने सेलुलर पहचान को समझने के लिए मौलिक महत्व का है.
पीआरसी 2-मध्यस्थ क्रोमैटिन डोमेन सहित क्रोमैटिन डोमेन गठन की जांच करने के लिए डिज़ाइन किए गए पिछले प्रयोगात्मक प्रणालियों के सभी, स्थिर राज्य की स्थितियों के तहत प्रदर्शन किया गया, जो क्रोमैटिन डोमेन गठन की घटनाओं को ट्रैक करने में असमर्थ हैं कक्षों. यहाँ, हम एक प्रेरक सेलुलर प्रणाली है जो प्रारंभिक भर्ती और क्रोमैटिन डोमेन के प्रचार पर नज़र रखता है उत्पन्न करने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं. विशेष रूप से, हम PRC2-मध्यस्थ दमनकारी क्रोमैटिन डोमेन है कि H3K27me2/3 शामिल के गठन पर नज़र रखने पर ध्यान केंद्रित. इस प्रणाली है कि chromatin डोमेन गठन के मशीनी विवरण पर कब्जा कर सकते हैं, अन्य क्रोमैटिन डोमेन को शामिल करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है, जैसे कि व्यापक रूप से अध्ययन डोमेन या तो H2AK119ub या H3K9me शामिल. जीनोमिक्स और इमेजिंग प्रौद्योगिकियों के साथ संयोजन में, इस दृष्टिकोण को सफलतापूर्वक क्रोमैटिन जीव विज्ञान में विभिन्न, महत्वपूर्ण सवालों का समाधान करने की क्षमता है.
Protocol
Representative Results
Discussion
दिए गए क्रोमैटिन डोमेन के गठन के दौरान मशीनी विवरण को समझने की दिशा में एक शक्तिशाली दृष्टिकोण, पहले डोमेन को बाधित करना और फिर कोशिकाओं के भीतर प्रगति में इसके पुनर्निर्माण को ट्रैक करना है। प्रक्रिय…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम पांडुलिपि के संशोधन के लिए Drs. L Vales, D. Ozata और एच. डी.आर. लैब हावर्ड ह्यूजेस मेडिकल इंस्टीट्यूट और स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों (R01CA199652 और R01NS100897) द्वारा समर्थित है.
Materials
| (Z)-4-Hydroxytamoxifen (5 mg) | Sigma | H7904-5MG | For induction of EED expression |
| 16% Paraformaldehyde aqueous solution (10×10 ml) | Electron Microscopy Sciences | 15710 | For immunofluorescence |
| 2-mercaptoethanol | LifeTechnologies | 21985-023 | For mESCs culture |
| 2% Gelatin Solution | Sigma | G1393-100ml | For mESCs culture |
| Accutase 500 ML | Innovative Cell Tech/FISHER | AT 104-500 | For mESCs culture |
| Alexa Fluor 594 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson immunoresaerch | 711-585-152 | For immunofluorescence |
| Aqua-Mount Mounting Medium | FISHER/VWR | 41799-008 | For immunofluorescence |
| CHAMBER SLD TC PRMA 8-CHM 16 PK | Fisher Sci | 177445PK | For immunofluorescence |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) – 10 mg | Life Tech | D1306 | For immunofluorescence |
| ERK inhibitor, PD0325901 | Stemgent | 04-0006 | For mESCs culture |
| ESGRO Recombinant Mouse LIF Protein | Millipore/Fisher | ESG1107 | For mESCs culture |
| FBS Stem Cell Qualified | Atlanta | S10250 | For mESCs culture |
| Gibson Assembly Master Mix | NEB | E2611L | For Donor template cloning |
| GSK3 inhibitor, CHIR99021 | Stemgent | 04-0004 | For mESCs culture |
| H3K27me2 (D18C8) rabbit mAB | Cell Signaling | 9728S | Antibody for ChIP-seq |
| H3K27me3 | Cell Signaling | 9733S | Antibody for ChIP-seq |
| Histone H2Av antibody (pAb) | Active motif | 39715 | Spike-in control for ChIP-seq |
| Knockout DMEM | Invitrogen | 10829-018 | For mESCs culture |
| L-glutamine | Sigma | G7513 | For mESCs culture |
| Lipofectamine 2000 | LifeTech | 11668019 | For transfection |
| MangoTaq DNA Polymerase | Bioline | BIO-21079 | For Genotyping PCR |
| Normal donkey serum (10 mL) | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | For immunofluorescence |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma/Roche | P0781 | For mESCs culture |
| pSpCas9(BB)-2A-GFP (PX458) | Addgene | 48138 | For gRNA cloning |
| QuickExtract DNA Extraction Solution | Lucigen | QE0905T | For Genotyping PCR |
| Triton X-100 | Sigma | T8787-250ML | |
| Zero Blunt PCR Cloning Kit | Thermo Fisher | K270020 | For Donor template cloning |
| Primers/gBlocks | |||
| EED-KO-gRNA-1 | Sequence: ctctggctactgtcaactag. gRNAs pairs to knockout EED in C57BL/6 ESCs for i-WT-r and i-MT-r systems. | ||
| EED-KO-gRNA-2 | Sequence: TAGGCTATGACGCAGCTCAG. gRNAs pairs to knockout EED in C57BL/6 ESCs for i-WT-r and i-MT-r systems. | ||
| EED-gRNA-inducible | Sequence: atggcaccccgaaattagaa. gRNA and Donor to generate i-WT-r system in the EED-KO background. | ||
| i-WT-r Donor | https://benchling.com/s/seq-l2LLlWNEnLrfGXcbdCxI. gRNA and Donor to generate i-WT-r system in the EED-KO background. | ||
| EED-gRNA-inducible | Sequence: atggcaccccgaaattagaa. gRNA and Donor to generate i-WT-r system in the EED-KO background. | ||
| i-MT-r Donor | https://benchling.com/s/seq-n8eiZCB2XAkOuzzpv6qM. gRNA and Donor to generate i-MT-r system in the EED-KO background. | ||
| Genotyping Primers | |||
| Gnt-EED-KO-FW-1 | Sequence: ctgtaggctgccatctgtga. Wild type allele will produce a product of 1.9 kb. Knockout allele will produce a product of 200 bp. | ||
| Gnt-EED-KO-REV-1 | Sequence: agccagggctacacagagaa. Wild type allele will produce a product of 1.9 kb. Knockout allele will produce a product of 200 bp. | ||
| Inducible_Genotype-FW-1 | Sequence: tgcagtgaaacaaatttggaa. When the casette is inserted, the primers will produce 1863 bp. The wild type allele will produce a product of ~200 bp. | ||
| Inducible_Genotype-REV-1 | Sequence: gagaggggtggcactgtaaa. When the casette is inserted, the primers will produce 1863 bp. The wild type allele will produce a product of ~200 bp. | ||
| Inducible_Genotype-FW-2 | Sequence: ccccctctttctccttttct. When the casette is inserted, the primers will produce 3200 bp. The wild type allele will produce a product of 1560 bp. | ||
| Inducible_Genotype-REV-2 | Sequence: atgcctgggtgaatgaaaaa. When the casette is inserted, the primers will produce 3200 bp. The wild type allele will produce a product of 1560 bp. |
References
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