Karaciğer Kanserinde SUMO Proteomunun Zenginleştirilmesi, İzolasyon, Tanımlama ve Karakterizasyonu Için Araçlar Olarak SUMO Bağlayıcı Varlıklar (SUBEs)

Summary

Burada, SUMO bağlayıcı varlıklar (SUBEs) kullanılarak hepatosellüler karsinomun fare modellerinden elde edilen insan hepatoma hücrelerinden ve karaciğer tümörlerinden elde edilen proteinleri hem insan hepatoma hücrelerinden hem de karaciğer tümörlerinden sumo bağlayıcı varlıklar (SUBEs) kullanarak zenginleştirmek, izole etmek, tanımlamak ve karakterize etmek için bir protokol sayılmaktadır.

Abstract

Post-translational modifikasyon ökaryotik hücrelerde protein homeostaz ve fonksiyon düzenleyen önemli bir mekanizmadır. Karaciğer kanserinde tüm ubiquitin benzeri proteinler arasında, SUMO tarafından modifikasyon (Küçük Ubiquitin MOdifier) en çok dikkat verilmiştir. Endojen SUMOylated proteinlerin in vivo izolasyonu aktif SUMO-spesifik proteazların varlığı nedeniyle zordur. In vivo’nun SUMOlasyon unun ilk çalışmaları spesifik SUMOylated proteinlerin moleküler tespitine dayanıyordu (örn. batı lekeleri ile). Ancak, birçok durumda, antikorlar, genellikle modifiye olmayan rekombinant protein ile yapılan, ilgi proteinin SUMOylated formları immünopprecipitate vermedi. Nikel kromatografisu, SUMO moleküllerinin histidin etiketli versiyonlarını yakalayarak SUMOylation’ı incelemek için bir yaklaşım olmuştur. Bu yaklaşım esas olarak His-SUMO molekülleri ile ifade veya geçici transfected hücrelerde kullanılır. Bu sınırlamaları aşmak için, ENdojen SUMOylated proteinleri izole etmek için SUMO bağlayıcı varlıklar (SUBEs) geliştirilmiştir. Burada, insan hepatoma hücrelerinden ve karaciğer kanseri fare modelinden sumoylated substratların zenginleştirme, izolasyon ve tanımlanması için gerekli tüm adımları SUBEs kullanarak açıklar. Öncelikle insan hepatoma hücrelerinin ve karaciğer tümör doku örneklerinin hazırlanması ve lysis ile ilgili yöntemleri açıklıyoruz. Daha sonra, SUBEs ve kontrollerin hazırlanması ayrıntılı bir açıklama protein pull-down tahlilleri için protokol ile birlikte ayrıntılı olarak açıklanır. Son olarak, SUMOylated proteomun tanımlanması ve karakterizasyonu için mevcut seçenekler, yani karaciğer tümörlerinden belirli bir SUMOylated substrat saptanması için batı-leke analizinin kullanılması veya kullanımı ile ilgili bazı örnekler verilmiştir. hepatom hücrelerinde SUMOylated proteom ve etkileşimom yüksek iş yapma özelliği için kütle spektrometresi tarafından proteomik.

Introduction

Karaciğer kanseri dünya çapında altıncı en sık görülen kanser ve kanserile ilişkili ölümlerin ikinci nedeni¹. Hepatosellüler Karsinom (HCC) primer karaciğer kanserinin en yaygın şeklidir. Tarihsel olarak, HCC gelişimi için ortak risk faktörleri kronik hepatit B veya C enfeksiyonu ve kötü niyetli alkol tüketimi dahil. Son yıllarda, metabolik sendrom, Tip 2 diyabet non-alkolik yağlı karaciğer hastalığı (NAFLD) HCC gelişimi için risk faktörleri olarak ortaya çıkmıştır². HCC çok heterojen, hem fenotipik hem de genetik olarak, sinyal yollarının karmaşık bir ağ bozulur nerede. Son yıllarda HCC patogenezinde bulunan moleküler yollar hakkındaki bilgimizde bir artış olmasına rağmen, HCC yönetimi için hala etkili bir tedavi yaklaşımı bulunmamaktadır. Birçok yollar HCC aktive edilir ve bir inhibe genellikle diğer yollar tarafından tazminat sürücüler³. Bu HCC tedavi ederken en büyük zorluklardan biri olmuştur. Böylece, birden fazla sinyal yolları aynı anda proteinlerin PTM’ler tarafından düzenlenebilir gibi, daha küresel bir yaklaşım karaciğer kanseri klinik yönetimi için potansiyel bir terapötik yaklaşım sağlayabilir, örneğin, post-translational değişiklikler (PtM) hedefleme.

Post-translational değişiklikler protein homeostaz ve fonksiyonları düzenleyen anahtar mekanizmalar olarak kabul edilir⁴. Yapısal ve fonksiyonel değişiklikler PTM’ler tarafından, bu nedenle proteom çeşitliliği artan tanıtılır. En yaygın PTM’ler arasında fosforilasyon, metilasyon, asetilasyon, glikozilasyon, ubikitinasyon ve ubikitin benzeri proteinlerin (UbLs) konjugasyonu sayılabilir. Tüm UbL’ler arasında, SUMO (Small Ubiquitin MOdifier) tarafından protein modifikasyonu transkripsiyon, hücresel lokalizasyon, DNA onarımı ve hücre döngüsü progresyonu da dahil olmak üzere çeşitli hücresel süreçlerdeki kritik rolüyle birlikte dikkat çekmiştir. ⁵. Son zamanlarda, SUMOylation karaciğer kanserinde değişmiş olduğu gösterilmiştir^6,7,8,9, ve belirli proteinlerin SUMOlasyon değişiklikleri ilerlemesinde rol oynadığı tarif edilmiştir kansere bağlı hastalıklar⁹.

Memelilerde, SUMO-1’den SUMO-5’e kadar beş SUMO paralogueu vardır. Bugüne kadar, endojen SUMO-4 ve endojen SUMO-5 konjugasyon reaksiyonlarının varlığı hakkında deneysel bir kanıt yoktur protein düzeyinde^10,11,12. Memelilerde sumoylation üç enzim, heterodimerik SUMO aktive enzimi (SAE1/SAE2) veya E1, SUMO konjuge enzim (Ubc9) veya E2 ve her hedef protein için özel bir SUMO-E3-ligase içeren enzimomatik tiyol-ester kaskad tarafından gerçekleştirilir. SUMO E3s birkaç ailenin eylem SUMO özgü proteazlar ile dinamik bir denge gibi görünüyor (SUSPs veya SENP)¹³ SUMOylation reaksiyonu son derece geri dönüşümlü hale. Ayrıca, SUMOylated protein in sadece küçük bir kısmı karşı non-SUMOylated toplam protein mevcuttur. Bu nedenle, in vivo endojen SUMOylated proteinleri izole oldukça zorlu¹³.

IN Vivo’nun SUMOtion başlangıçta batı lekeleri tarafından ilgi nin proteinine karşı antikorlar kullanılarak çalışılmıştır¹⁴. Proteinin immünopresididispesifik antikorlarla yapıldı ve page-western blot anti-SUMO antikorları ile yapıldı. Bu stratejinin temel sorunu, modifiye edilmeyen rekombinant proteine karşı üretilen antikorların her zaman bir proteinin SUMOylated formunu immünopprecipitate edememesidir. Alternatif olarak, nikel kromatografisi sonra histidin geçici ekspresyonu etiketli (His6) SUMO moleküllerinin sürümleri ve ilgi proteini hücrelerde SUMOition çalışma için kullanılmıştır. Bu temelde, his6-SUMO¹⁵ifade hücreleri SUMO modifiye formları tespit etmek daha uygun olacaktır. In vivo çalışmalar için, tandem-SUMO-etkileşim motifleri (SIM) tabanlı zenginleştirme poliSUMO conjugates arıtma için gösterilmiştir¹⁶. Diğer gruplar primer hücrelerde endojen SUMOylation araştırmak için uygulanabilir bir araç sağlayan epitop etiketli antikor SUMO yaklaşımları kullanarak edilmiştir, dokular, ve organlar^17,18. Ve daha yakın zamanda, Nielsen ve meslektaşları hücre ve dokularda endojen ve siteye özgü SUMO tanımlamak için antikor bazlı zenginleştirme kullandık¹⁹.

In vivo’nun SUMOiletion’un rolü hakkında tamamlayıcı bilgi sağlamak amacıyla, SUMO tuzakları olarak da bilinen SUMO bağlayıcı varlıklar (SUBEs)²⁰geliştirilmiştir. Alaka, tandem ubiquitin bağlayıcı varlıklar (TUB) SUBEs kavramsal öncüleri olarak kabul edilir ve tespit ve poliubiquitileted proteinlerin izolasyon uiçin ticari olarak kullanılabilir araçlardır²¹. SUBEs, SIM’lerin tandem tekrarlarını oluşturan rekombinant proteinlerdir ve bu nedenle SUMO substratlarına genel yakınlıkta artış la modifiye proteinler üzerindeki SUMO moleküllerini tanırlar. SUMO-tuzaklar bir E3 ubiquitin-protein ligaz RNF4-türetilmiş SIM2 ve SIM3 motifleri tandem tanıtılarak, glutatyon S-transferaz içeren bir vektör içine (GST), bir heterolog taşıyıcı protein²⁰. SUBEs mono-SUMOylated hedef proteinleri tanımlamak için düzgün kullanılamaz rağmen, bu yöntem in vivo poli-SUMO hedef proteinlerin saflaştırılması ve tanımlanmasını kolaylaştırmak için bir araç sağlar. Burada, hem insan hepatomhücrelerinde hem de karaciğer kanseri nin araştırılmasında önemli bir araç olan fare karaciğer biyopsilerinde SUMOylated proteinleri izole etmek için SUBEs uygulamasını açıklıyoruz. Bu el yazmasında açıklanan protokolün genel şeması Şekil 1’degösterilmiştir.

Protocol

Tüm deneyler cic bioGUNE hayvan bakımı ve kullanımı için kurumsal komiteler tarafından onaylanmıştır. Hayvanların acı çekmesini en aza indirmek ve kullanılan hayvan sayısını azaltmak için tüm çabalar sarf edildi. 3 aylık erkek glisin N-metiltransferaz(Gnmt) eksikliği(Gnmt−/−) ve yabani tip çöpleri(Gnmt+/+) kullanıldı. 1. Hücre Hazırlama ve Lysis NOT: Burada Huh-7 (insan hepatoma hücre hattı) ve THLE2 (insan hepatik hücre hattı) kullanılmıştır. Maintain cells in P100 plates in standard growth media at 37 °C in a humidified atmosphere of 5% CO2-95% humidity. P100 plakalarında hücreleri 1.2-1.5 × 106 hücre bir Neubauer hemositometri sayma odası kullanarak hücreleri sayarak çanak başına bir yoğunlukta kaplama büyümek. DMEM’de Kültür Huh-7 fetal sığır serumu (FBS), %1 penisilin-streptomisin-amphotericin B (PSA) ve %1 glutamin ile desteklenmiştir. Kültür yemeklerinde kültür thle2 hücreleri 0.01 mg/mL fibronektin, 0.01 mg/mL büyükbaş serum albumini (BSA) ve 0.03 mg/mL kollajen tip i bronşiyal epitel hücre büyüme bazal orta (BEGM) ile takviye li büyüme ortamı nda çözünmüş büyüme faktörleri (%0.4 BPE, %0.1 insülin, %0.1 hidrokortizon, %0.1 retinoik asit, %0.1 transferrin, %0.1 triiyodotirin ve FBS, %1 PSA, 5 ng/mL epidermal büyüme faktörü (EGF) ve 70 ng/mL fosfotolamamin. Deneyin son noktasında, ortam ları tabaklardan alıforve 5 mL steril 1x fosfat tamponlu salin (PBS) ile yıkayın. 500 μL lysis tampon (50 mM Tris pH 8.5, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, %1 nonidet P-40 (NP40) kullanılarak buz üzerine yerleştirilen plakanın üzerine doğrudan lyse hücreleri, her P100 çanak için tam EDTA içermeyen proteazatör kokteyli ve 50 μM PR-619 ile desteklenir. Bir hücre kazıyıcı kullanarak, yavaşça Lysis orta içine plakanın alt hücreleri kazıyın.NOT: Tedaviden sonra plaka tabanını görsel olarak inceleyerek tüm hücrelerin plakadan ayrılıp ayrılmadığını kontrol edin. Alternatif olarak, hücre ortamını azarlayarak tripsinizasyon ile hücreleri hasat ve 1 mL 1x (%0.05) ekleyin tabağa tripsin-EDTA, hücreleri kapsayacak kadar ve plakayı 37 °C, %5 CO2ve ~5 dk için nem olarak belirlenen kuvöze yerleştirerek tüm hücrelerin plakadan ayrılmasını sağlar. Tripsinizasyonu durdurmak için önceden ısıtılmış büyüme ortamı2 mL ekleyin. 10 dk için 150 g santrifüj ve supernatant aspire. 10 dk boyunca 150 x g’da 1x PBS ve santrifüj ile yıkayın. Supernatant’ı azarladıktan sonra, her P100 çanak için tam EDTA içermeyen proteaz inhibitörü kokteyli ve 50 μM PR-619 ile tamamlanan 500°L lysis tamponu (50 mM Tris pH 8.5, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, %1 NP40) ekleyin.NOT: PR-619 eklenmesi çok önemlidir. 15.500 x g ve 4°C’de 10 dk. Supernatant’ı başka bir tüpe aktarın ve peleti atın.NOT: Protokol burada duraklatılabilir ve numuneler ileri analizedilinceye kadar -80 °C’de saklanır. 2. Doku Hazırlama ve Lysis Hayvan kurban üzerine, fare karaciğerleri toplamak, soğuk PBS ile yıkayın ve sıvı nitrojen hemen donma snap. Numuneleri ileri analize kadar −80 °C olarak saklayın. 1 mL buz gibi buzlu lysis tamponunda snap-frozen/veya taze karaciğerlerden 75 mg parça homojenize edin (50 mM Tris pH 8.5, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, %1 NP40, tam EDTA içermeyen protaz inhibitör kokteyli ve 50 μM PR-619). Homogenizer’ı 6500 x rpm, her biri 2 x 60 s’de 30 s duraklatma ile çalıştırın (Bkz. Malzeme Tablosu). Numuneleri 15, 500 x g ve 4 °C’de 10 dk. Alternatif olarak, sıvı azot dondurulmuş dokuların 75 mg triturate. Daha sonra 1 mL likis tamponundaki dokuyu geri kazanım. Numuneyi 15, 500 x g ve 4 °C’de 10 dk.NOT: Protokol burada duraklatılabilir ve numuneler ileri analizedilinceye kadar -80 °C’de saklanır. 3. GST-SUBEs veya GST Kontrolü Glutatyon-Agarose Boncuk bağlanması NOT: GST-SUBEs veya GST kontrolü sentezi bu makalenin kapsamı dışındadır ve daha önce yayınlanmışliteratür20gözden geçirilebilir. Alternatif olarak, GST- ve Control SUBE’leri ticari olarak mevcuttur (örneğin, SignalChem). Glutatyon boncuk hazırlanması Lyophilized glutatyon-agarose boncuk 70 mg de-iyonize su 1 mL ekleyin. Boncukları bir gecede 4 °C’de (veya oda sıcaklığında en az 30 dakika) yeniden oluşturun. Şişkinlik sonra iyice boncukyı yıkayın (genellikle lyophilized toz agarose boncuk mevcut laktoz ve etanol kaldırmak için). Bunu yapmak için, ilk olarak 10 mL de-iyonize su veya PBS ile yıkayın ve ardından oda sıcaklığında 5 dk için 300 x g’de santrifüj edin. Bunu üç kez yap. 3 yıkandıktan sonra, (v/v) bulamaç elde etmek için pbs 1 mL’deki boncukları yeniden askıya alın.NOT: Bu hacim 10 numunenin analizi için uygundur. Her örnek için, glutatyon boncuk bulamacının100μL’sine 100 μL VE 500 μL PBS’ye 100 μg GST-SUBEs veya GST kontrolü ekleyin .NOT: Faiz inkişa edilmiş proteinlerin göreceli bolluğu, pull-down’larda kullanılan GST-SUBE miktarını belirler. Her yeni deney modeli için, anti-SUMO2/3 antikorları kullanarak veya ilgi proteinlerine karşı (Liver Kiazas B1 (LKB1) kullanarak girişi, bağlanmasını ve akış yoluyla (FT) malzemeyi batıya doğru blotlayarak gerçek deneyden önceki durumu analiz edin. Tüm GST-SUBE’leri veya GST kontrollerini 3,2’de hazırlanmış boncuklarla, rotator veya mini silindirde yavaşça dönerek (Malzeme Tablosu’nabakın) en az 2 saat (yavaş bağlama reaksiyonu) için 4 °C’de kuluçkaya yatırın.NOT: 1 mM dithiothreitol (DTT) eklemek, glutatyon boncuklarına GST bağlanmasını artırır. Oda sıcaklığında 5 dk için 300 x g santrifüj ile agarose boncuk kurtarın. Sonunda, % 50 (v / v) bulamaç elde etmek için PBS boncuk resuspended.NOT: Protokol burada duraklatılabilir ve numuneler ileri analizedilinceye kadar -80 °C’de saklanır. 4. GST Aşağı Asa çekin Adım 1.5, 2.3 veya 2.5’ten sonra toplam hacmin 1/10’unu (örn. 50 μL) alın ve aynı hacimde 3x kaynama tamponu (250 mM Tris-HCl pH 6,8, 500 mM β-mercaptoethanol, gliserol, SDS, bromofenol mavisi) seyreltin. Bu kesir GIRIŞ olarak kabul edilir. 1.5, 2.3 veya 2.5 ila 100 μL glutatyon boncuk bulamaç adımlarından 450 μL açıklıklı lysate ekleyin. Lysate’yi boncuklarla kuluçkaya yatırın, en az 2 saat boyunca 4 °C’de yavaşça döndürün.NOT: Alternatif olarak, toplam hacmi 450 μL olan 1.5, 2.3 veya 2.5 (Bradford testi ile ölçülür) toplam proteinden 100-200 μg’lık toplam protein kullanılabilir. 5 dakika için 300 x g bir mikrofuge boncuk aşağı spin ve analiz için supernatant toplamak. Toplam hacmin 1/10’unun (örn. 50°L) ayrı bir tüpe aktarılması nı ve 3x kaynama tamponunun eşit hacminde seyreltin. Bu kesir akış yoluyla (FT) fraksiyonudur. Kalan numuneyi 1 mL buz gibi PBS, %0,05 Ara 20 ile üç kez yıkayın, 4 °C’de ve 300 x g’da 1 dk. Sıvı kalıntısı kalmamasını sağlamak için dikkatlice aspire edin. Boncuklar SUBEs BOUND (SB) fraksiyonuna karşılık gelir. Numuneyi 15 μL 3x kaynama tamponu ve 15 μL likli likit tampon ile verin. Buna BOUND Fraksiyonu denir. 5. Batı Blot analizi ile SUMO Hedeflerinin Tanımlanması ve Karakterizasyonu Daha önce açıklandığı gibi bir anti-SUMO2/3 antikor veya tercih diğer spesifik antikor kullanarak batı leke analizi yapmak22. 6. KÜTLE Spektrometresi ile SUMOylated Proteomu tanımlama ve karakterizasyonu NOT: Kütle Spektrometresi (MS) analizinde, numuneler Wisniewski ve ark.23tarafından tanımlanan Filtre Destekli Numune Hazırlama (FASP) yöntemi kullanılarak işlenmiştir. Evre ucu C18 mikrokolonları kullanarak peptidleri tuzlayın ve MS analizinden önce %0,1 formik asit (FA) ile yeniden askıya alın. Örnekleri bir LC-MS sistemine yükleyin (bkz. Malzeme Tablosu)ve bunları üç aylık olarak analiz edin (teknik çoğaltmalar)(Şekil 2b). Ilişkili bir yazılım kullanarak protein tanımlama ve bolluk hesaplamaile devam edin. İstatistiksel analiz ve ısı haritası üretimi için verileri Perseus platformuna (http://www.perseus.tufts.edu/hopper/) yükleyin. Bollukların karşılaştırılması için permütasyon tabanlı yanlış bulma oranı (FDR) düzeltilmiş bir t-testi uygulayın. Q < 0.05 ve 2'den büyük SUBEs/GST oranı olan proteinler zenginleştirilmiş24olarak kabul edildi.NOT: Son tahlilde en az iki farklı peptid ile tanımlanan proteinler dikkate alınır.

Representative Results

Karaciğer Tümör Biyopsilerinde Spesifik BIR SUMOlasyon Substratının Batı Leke Analizi Ile Belirlenmesi Karaciğer Kiazaz B1 (LKB1) SUMOylation son zamanlarda karaciğer kanseri önemli bir onkojenik sürücü olduğu gösterilmiştir9,25. Glisin N-metiltransferaz(Gnmt)eksikliği fareler , genellikle Gnmtolarak anılacaktır−/−, spontan hepatosellüler karsinom gelişen bir modeldir (HCC), primer karaciğer kanserinin en yaygın türü. SUBEs zenginleştirmek ve karaciğer kanseri fareler ve yabani tip çöp(Gnmt+/+)ile Gnmt−/− fareler hem de SUMOylated proteinleri izole etmek için kullanılmıştır. Şekil 2a’da,SUBEs pull-down telinde elde edilen üç farklı fraksiyonun (giriş, FT ve BOUND) Ponceau S boyaması yer almıştır. Ponceau S lekesi, Batı lekeleri tarafından değerlendirilecek lekeli proteinlerin yüklenmesi ndeki olası zararlı etkiyi kontrol etmek için yararlıdır. Şekil 2b’de endojen SUMOylated LKB1’i yakalamak için SUBEs kullanılarak LKB1’in Batı leke analizi gösterilmiştir. Karaciğer tümörlerinde LKB1 SUMOylation düzeyleri artar. Batı leke analizinde, girdi fraksiyonunun Ponceau boyaması ile eşit yükler ve transfer edilen proteinler gözlendi ve yıkAmalardan sonra (fraksiyondan akış) önemli ölçüde değiştirilmemiştir. SUBE’lerle yakalanan protein miktarı, özellikle tümörlerde anlamlı olarak daha yüksekti. Alternatif olarak, Coomassie mavi ile yinelenen jel boyama benzer bilgiler sağlayabilir. Bazı proteinlerin p53 veya SUMOylated formları gibi yapışkan proteinler GST kontrolüne bağlanabilir. Arka planı kaldırmak için düşük yoğunluklu agarose boncuklar kullanın, BSA ile kaplama yapın veya ek yıkarlar dahil edin. Ancak, bu Kütle Spektrometresi gibi uygulamaları etkileyebilir ve düşük yakınlık etkileşimli proteinlerin kaybına neden olabilir. SuMO Etkileşimomu’nun İnsan Hepatoma Hücrelerinde Kütle Spektrometresi Analizi ile Karakterizasyonu SUMO-trap’in doğal olarak SUMOylated proteinleri ile etkileşime girme kapasitesini araştırmak için Huh-7 (insan hepatoması) ve dönüştürülmeyen karaciğer epitel idamı olan THLE2 hücre hatları kullanıldı. İlk adım, SUBE’ler ile yakalanan toplam malzemenin görselleştirilmesi ve GST’nin negatif kontrol olarak kullanılmasıdır. Bu amaçla Şekil 3a’dagösterildiği gibi konvansiyonel protein boyama protokollerini kullanabiliriz. Sonra kütle spektrometresi analizini yaptık. Huh7 GST örneklerinde (sırasıyla her yük için 2339, 2297 ve 2168) ortalama 2268 protein tanımlanırken, Huh7 SUBEs örneğinde (2815, 2817 ve 2806) ortalama 2812 protein tespit edilmiştir. Çıkarmadan sonra SUBE’lerde 742 protein zenginleştirilmiştir. Diğer taraftan, THLE2 GST örneklerinde (sırasıyla 2476, 2520 ve 2495) ortalama 2497, SUBE’lerde (2823, 2783 ve 2684) ise 2763 protein tespit edilmiştir. Bunlardan 577’sinin SUBEs örneklerinde zenginleştirilmiş olduğu kabul edilmiştir. Teknik çoğaltmaların analizi, kullanılabilir varsayılan ayarlar (Öklid mesafesi, ortalama bağlantı ve k-araçları yla önceden işlenmiş) kullanılarak hesaplanan Şekil 3b’degösterilen ısı haritasını alır. Isı haritası, her hücre hattındaki en önemli ve özel olarak zenginleştirilmiş 100 proteinin dağılımını gösterir. Şekil 1: Karaciğer kanseri nin incelenmesi için SUMOylated proteome in vivo zenginleştirme, izolasyon ve tanımlama ve karakterizasyonu için kullanılan protokol akış şeması şematik diyagramı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 2: Hepatosellüler Karsinom fare modellerinde SUMO-2 ile LKB1 modifikasyonu.(a) Subes pull-down tsay elde edilen üç farklı kesirler (giriş, Akış (FT) ve BOUND) Ponceau S boyama. (b) Endojen SUMOylated LKB1 yakalamak için SUMO bağlayıcı varlıklar (SUBEs) kullanarak LKB1 Batı leke analizi; GAPDH yükleme kontrolü olarak kullanılır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 3: TÜMÖRAL Huh-7 ile dönüşümsüz karaciğer epitelyal THLE2 insan hücre hatları arasındaki farklar.(a) Yakalanan protein materyalinin GST (Negatif kontrol) ve SUBEs ile sypro boyama. (c) Huh-7 ve THLE2 SUBE örneklerinde farklı olarak zenginleştirilmiş proteinleri gösteren ısı haritası. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Discussion

Burada, karaciğer kanserinin in vivo modellerinde SUMOylated proteinlerin zenginleştirilmesi, izolasyonu ve tanımlanması ve karakterizasyonu için SUBE kullanımını bildiren metodolojinin tam ve ayrıntılı bir açıklamasını sunmuş olduk. Hem fare karaciğeri tümörlerinde hem de insan hepatoma hücrelerinde, sumoylated proteinleri doğru bir şekilde izole etmeyi ve tespit etmeyi ve SUMOylated proteom ve etkileşimomun yüksek işlemli karakterizasyonunu gerçekleştirebildik. SUBEs sentezi bu makalenin kapsamı dışında olmasına rağmen, daha fazla bilgi için aşağıdaki referanslar²⁶bakılmalıdır . Açıklanan protokol hızlı ve çok hassastır ve protokolün kritik adımı SENP inhibitörlerinin kullanımını içerir (PR-619). Alternatif olarak, lysis tamponundaki NEM(N-Etilmaleimide) ve IAA (2-Iodoacetamide) gibi kimyasal izopeptidaz inhibitörleri kullanılabilir, ancak önceki raporlar SUBEs protokolü için PR-619 kullanımının diğer inhibitörleri glutatyon boncuk²⁰GST bağlama ile müdahale.

SUBEs, SIM’lerin tandem tekrarlarını oluşturan rekombinant proteinlerdir ve bu nedenle SUMO substratlarına genel yakınlıkta artış la modifiye proteinler üzerindeki SUMO moleküllerini tanırlar. Yüksek özgüllüğü ve duyarlılığı nedeniyle, SUMOylated proteom izolasyonu için SUBEs kullanımı, spesifik SUMOylated proteinlerin batı-blot tarafından antikorlar kullanılarak saptanması gibi literatürdeki diğer yaklaşımlara göre avantajlıdır SUMO moleküllerinin farklı histidin etiketli versiyonlarını kullanarak ilgi proteini veya nikel kromatografisi. Ancak, SUBEs protokolü denandırıcı olmayan koşullar altında gerçekleştirildiği için, SUMOylated proteinler ile diğer etkileneyen proteinler arasındaki etkileşimin sürdürüldİğİ göz önünde bulundurulmalıdır. Bu nedenle, SUMOylated hedef proteinlerin sadece bir listesi yerine SUMO etkileşimom hakkında bilgi elde. Bu nedenle, tanımlanan proteinin bir SUMO hedefi mi yoksa etkileşen bir faktör mü olduğunu doğrulamak için daha fazla deney yapılması gerekmektedir. SUBEs diğer sınırlama kontrol GST tuzakları oksidatif stres ile ilgili birçok arka plan proteinleri yakalamak mümkün olmasıdır. Bu konu özellikle tekniğin yüksek hassasiyeti nedeniyle MS analizi sırasında önemlidir. Bu sınırlamaları aşmak için biyotinylated SUMO-tuzaklar (bioSUBEs) geliştirilmiştir²⁶. SUBEs bir diğer sınırlama biz sadece SUMO 2 ve SUMO 3 tarafından modifiye proteinleri yakalamak mümkün olduğu gerçeği nde bulunur oysa SUMO 1-modifiye proteinler izole edilemez.

SUBEs kullanımı diğer endişe prosedür için gerekli başlangıç malzeme miktarı ile ilgilidir. SUMOylated proteinleri yakalamak için kullanılan başlangıç materyali keşfedilen farklı deneysel koşulları göz önünde bulundurmalıdır. Bazal SUMOylation çeşitli hücresel bağlamlarda rapor edilmiş olsa da, SUMOylation kuvvetle birden fazla stres koşulları / uyaranların sonra indüklenen bir süreçtir. İşlenmemiş ve tedavi edilmemiş numuneleri karşılaştırıyorsanız, sütunun doygun olmadığından ve bu koşullar arasında farklılıklar gözlemlenebilmelidir. Analiz ettiğimiz fare fenotipleri söz konusu olduğunda hiçbir tedavi kullanılmamış ve bazal SUMOylation düzeyleri düşüktür. Bu nedenle yüksek miktarda protein kullanılmıştır. Arka plan düzeyi GST kullanılarak kontrol edilmeli ve spesifik olmayan bağlama yüksekse, başlangıç malzemesi miktarı veya bağlama süresi azaltılmalıdır. FT fraksiyonunun analizi, bu tuzaklar poli-SUMOylated proteinleri tercih etse ve toplam tükenme beklenmese bile yakalama veriminin göstergesi olabilir, yakalama verimliliği iyi görüldüğünde genel olarak toplam sümülasyonda bir azalma gözlenir. En iyi.

Son olarak, SUBEs teknolojisinin diğer uygulama gerçek zamanlı Yüzey Plazmon Rezonans (SPR) hücre özleri²⁷SUMOylated proteinler ile gerçek zamanlı etkileşimleri sağlayan SUBEs teknolojisinin kombinasyonu içerir. Ayrıca, daha yakın zamanda, biyotinylated SUMO-tuzaklar (bioSUBEs) daha büyük etiketleri ile ilişkili arka plan azaltmak için avantajı ile geliştirilmiştir, örneğin, kütle spektrometresi analizi sırasında²⁶. Buna ek olarak, bioSUBE versiyonu streptavidin farklı floresan boyalar biotin bağlayıcı yararlanarak streptavidin etiketli kullanarak floresan tarafından canlı hücrelerde SUMOylated proteinleri tespit etmek için kullanılabilir. Ayrıca, SUMOylated proteinlerin saptanması ve sayısallaştırılması için yöntemler hem GST hem de bioSUBEs versiyonları ile düşünülebilir.

Genel olarak, karaciğer kanserinde sumoylated proteom izolasyon ve karakterizasyonu için SUBEs kullanımı karaciğer kanserinde SUMOylation yolunun hala tam olarak bilinmeyen rolü hakkında geniş bilgi sağlayan hızlı ve hassas bir yöntemdir.

Materials

(Gnmt−/−)/ (Gnmt+/+) mice	CIC bioGUNE
0.5% Trypsin-EDTA	Life Technologies	15400-054
BEBM	Lonza/Clonetics Corporation	cc-3171
BEGM Bullet Kit	Lonza/Clonetics Corporation	CC3170
Bromophenol blue	Sigma	115-39-9
BSA	Sigma	A4503
C18 microcolumns	Millipore	Z720070
Collagen type I	Santa Cruz Biotechnology	sc-136157
Complete tablets EDTA-free	Roche	4693132001
DMEM	Life Technologies	A14431-01
DTT	Sigma	43815
EDTA	Sigma	E6758
EGF	Sigma	e9644
FBS	Life Technologies	10270
Fibronectin	Life Technologies	33010018
Glutamine	Life Technologies	25030-024
Glutathione agarose beads	Sigma	G4510
Glycerol	Sigma	G5516
GST-Control	SignalChem	G52-30H
GST-SUBEs	SignalChem	S291-340G
Huh7	CLS (Cell Lines Service)	300156	https://clsgmbh.de/
IAA (2-Iodoacetamide)	Merck	L58046844
LKB1 antibody	Santa Cruz Biotechnology	sc-32245
Mini LabRoller Rotator	LABNET	H5500	https://www.labnetinternational.com
NaCl	Merck	106404041000
nanoElute	BRUKER		https://www.bruker.com/
NEM (N-Ethylmaleimide)	Sigma	E3876
NP40	Fluka	74385
PBS	Life Technologies	14190-094
Peaks software	Bioinformatics Solutions Inc.		http://www.bioinfor.com/
Phosphoetanolamine	Sigma	P0503
Ponceau S solution	Sigma	P7170
PR-619	Merck	662141
Precellys 24	Bertin Technologies	P000669-PR240-A
PSA	Life Technologies	151-40-122
PSG	Life Technologies	10378-016
SDS	Sigma	L3771
SUMO2/3 antibody	Abcam	Ab3742
THLE-2	ATCC	ATCC CRL-2706	http://www.lgcstandards-atcc.org
timsTOF Pro with PASEF mass spectrometer	BRUKER		https://www.bruker.com/
β-mercaptoethanol	Sigma	60-24-2