Micro-fragmentation humaine des tissus adipeux pour le phénotypage cellulaire et la caractérisation du secretome
Summary
Ici, nous présentons la micro-fragmentation sans enzyme s’adipeux humain à l’aide d’un dispositif système fermé. Cette nouvelle méthode permet l’obtention de grappes de tissus adipeux sous-millimétriques adaptées à la transplantation in vivo, à la culture in vitro et à l’isolement et à la caractérisation des cellules.
Abstract
Au cours de la dernière décennie, les greffes de tissus adipeux ont été largement utilisées en chirurgie plastique et en orthopédie pour améliorer la réprobation et/ou la régénération des tissus. En conséquence, les techniques de récolte et de traitement des tissus adipeux humains ont évolué afin d’obtenir rapidement et efficacement de grandes quantités de tissu. Parmi ceux-ci, la technologie du système fermé représente un système novateur et facile à utiliser pour la récolte, le traitement et la réinjection de tissus adipeux raffinés en peu de temps et dans la même intervention (intraopératoire). Le tissu adipeux est recueilli par liposuccion, lavé, émulsionné, rincé et haché mécaniquement en grappes cellulaires de 0,3 à 0,8 mm. La transplantation autologue du tissu adipeux mécaniquement fragmenté a montré une efficacité remarquable dans différents traitements comme la médecine esthétique et la chirurgie, la chirurgie orthopédique et générale. La caractérisation du tissu adipeux micro-fragmenté a indiqué la présence de petits vaisseaux intacts dans les amas d’adipocyte ; par conséquent, la niche périvasculaire est laissée imperturbable. Ces grappes sont enrichies en cellules périvasculaires (c.-à-d. ancêtres de cellules souches mésenchymales (MSC) et l’analyse in vitro a montré une libération accrue de facteurs de croissance et de cytokines impliqués dans la réparation et la régénération des tissus, comparativement aux MSC dérivés enzymatiquement. Ceci suggère que le potentiel thérapeutique supérieur du tissu adipeux microfragmenté s’explique par une fréquence plus élevée des MSC sumptives et de l’activité sécrétrice améliorée. On ne sait pas si ces péricytes ajoutés contribuent directement à un facteur de croissance plus élevé et à la production de cytokine. Cette procédure cliniquement approuvée permet la transplantation de MSC présumés sans avoir besoin d’expansion et/ou de traitement enzymatique, contournant ainsi les exigences des lignes directrices sur les GMP et réduisant les coûts des thérapies cellulaires.
Introduction
Le tissu adipeux, longtemps utilisé comme remplisseur en chirurgie reconstructive et esthétique, est récemment devenu plus populaire en médecine régénérative autrefois reconnue comme source de cellules souches mésenchymales (MSC)1. Lipoaspirates dissociéens enzymatiquement en suspensions unicellulaires donnent une fraction vasculaire stromale sans adipocyte (SVF) qui est utilisée inchangée chez le patient ou, plus généralement, est cultivée pendant plusieurs semaines dans les MSCs2.
Cependant, la dissociation enzymatique rompt les microenvironnements tissulaires, séquant les cellules régulatrices voisines des cellules régénératrices présumées qui deviennent considérablement modifiées par la culture in vitro. Pour éviter de tels artefacts expérimentaux et les altérations fonctionnelles qui en découlent, des tentatives ont été faites pour traiter le tissu adipeux à des fins thérapeutiques tout en maintenant sa configuration indigène aussi intacte que possible3,4. Notamment, la perturbation mécanique de tissu a commencé à remplacer la dissociation enzymatique. À cette fin, l’immersion complète fermé système micro-fragments lipoaspirates en sous-millimètre, sans sang et sans huile grappes tissulaires (par exemple, Lipogems) via une séquence de filtration de tamis et de marbre d’acier induit perturbation3. La transplantation autologue du tissu adipeux micro-fragmenté, utilisant cette technologie fermée de système, a été réussie dans les indications multiples, couvrant des cosmétiques, orthopédiques, proctologie et gynécologie4,5, 6,7,8,9,10,11,12,13.
La comparaison entre le tissu adipeux micro-fragmenté humain (MAT) obtenu avec le dispositif fermé de système et Le SVF isogénique a indiqué qu’en ce qui concerne la distribution vasculaire/stromale de cellules et l’activité sécrétrice dans la culture, MAT contient plus de péricytes, qui sont présumé MSCs14, et sécrète des quantités plus élevées de facteurs de croissance et cytokines15.
Le présent article illustre la micro-fragmentation sans enzymes du tissu adipeux sous-cutané humain à l’aide d’un dispositif système fermé, et le traitement ultérieur de ces tissus adipeux micronisés pour la culture in vitro, l’immunohistochimie et l’analyse FACS, afin d’identifier les types de cellules présentes et les facteurs solubles sécrétés (Figure 1). La méthode décrite génère sans risque des organoïdes dérivés d’adipose sous-millimètres contenant des populations viables de cellules adipeuses dans une niche intacte, adaptée à d’autres applications et études.
Protocol
Representative Results
Discussion
Cet article décrit la fractionnement physique, utilisant un dispositif fermé de système, du tissu adipeux humain en petits groupes affichant la microanatomie normale de tissu adipeux.
Le tissu adipeux sous-cutané humain aspiré manuellement et la solution saline sont chargés dans un cylindre en plastique transparent contenant de grandes sphères métalliques de flipper-modèle qui, après secousse manuelle vigoureuse de l’appareil, rupture de la graisse en sous-millimètre Fragments. Les …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs tiennent à remercier Claire Cryer et Fiona Rossi de l’Université d’Édimbourg pour leur aide experte en cytométrie des flux. Nous tenons également à remercier le personnel de l’hôpital de Murrayfield qui a contribué en fournissant des échantillons de tissus.
Ce travail a été soutenu par des subventions de la British Heart Foundation et lipogems, qui a fourni des kits de traitement des tissus adipeux. Des échantillons de tissus humains pour adultes ont été obtenus avec la pleine autorisation éthique du South East Scotland Research Ethics Committee (référence : 16/SS/0103).
Materials
| 4% Buffered paraformaldehyde (PFA) | VWR chemicals | 9317.901 | |
| 0.9% NaCl Solution | Baxter | 3KB7127 | |
| AlexaFluor 555 goat anti-mouse IgG | Life Technologies | A21422 | |
| AlexaFluor 647 goat anti-Rabbit IgG | Life Technologies | A21245 | |
| Ammonium chloride | fisher chemicals | 1158868 | |
| Antigent Diluent | Life Technologies | 3218 | |
| Anti-Mouse Ig, κ/Negative Control (BSA) Compensation Plus | BD Biosciences | 560497 | |
| Avidin/Biotin Blocking Kit | Life Technologies | 4303 | |
| BD LSR Fortessa 5-laser flow cytometer | BD Biosciences | Laser 405nm (violet)/375nm (UV) – filter V450/50 for DAPI and V450 antibodies; Laser 561nm (Yellow-green) – filter YG582/15 for PE antibodies; Laser 405nm (violet)/375nm (UV) – filter V710/50 for BV711 antibodies | |
| Biotinylated Ulex europaeus lectin | Vector Laboratories | Vector-B1065 | |
| BV711 Mouse IgG1, k Isotype Control | BD Biosciences | 563044 | |
| CD146-BV711 | BD Biosciences | 563186 | |
| CD31-V450 | BD Biosciences | 561653 | |
| CD34-PE | BD Biosciences | 555822 | |
| CD45-V450 | BD Biosciences | 560367 | |
| DAPI | Life Technologies | D1306 | stock concentration: 5mg/mL |
| Disposable liposuction cannula (LGI 13Gx185 mm – AR 13/18) | Lipogems | provided in the Lipogems surgical kit | |
| Diva software 306 (v.6.0) | BD Biosciences | ||
| DMEM, high glucose, GlutaMAX without sodium pyruvate | Life Technologies | 61965026 | |
| EGMTM-2 Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKitTM | Lonza | CC-3156 | |
| Fetal Calf Serum (FCS) | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| FlowJo (v.10.0) | FlowJo | ||
| Fluoromount G | SouthernBiotech | 0100-01 | |
| Gelatin | Acros Organics | 410870025 | |
| Lipogems Surgical Kit | Lipogems | LG SK 60 | |
| Mouse anti human- NG2 | BD Biosciences | 554275 | stock concentration: 0.5 mg/mL |
| PE Mouse IgG1, κ Isotype Control | BD Biosciences | 555749 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Polystirene round bottom 5 mL tube with cell strainer snap cap | BD Biosciences | 352235, 25/Pack | |
| Polystyrene round bottom 5 mL tubes | BD Biosciences | 352003 | |
| Rabbit anti human – PDGFRb | Abcam | 32570 | stock concentration: 0.15 mg/mL |
| Streptavidin conjugated-488 | Life Technologies | S32354 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | 84100-5kg | |
| Tissue infiltration cannula (17GX185 mm-VG 17/18) | Lipogems | provided in the Lipogems surgical kit | |
| Tris base | fisher chemicals | BP152-500 | |
| Type- II Collagenase | Gibco | 17101-015 | |
| V450 Mouse IgG1, κ Isotype Control | BD Biosciences | 560373 | |
| Widefield Zeiss observer | Zeiss | Objective used: Plan-Apo 20x/0.8 | |
| Zeiss Colibri7 LED light source ( LEDs: 385, 475, 555, 590, 630 nm) | Zeiss | DAPI: UV, excitation 385nm; 488: Blue, excitation 475nm; 555: Green, excitation 555nm; 647:Red, excitation 630nm |
References
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