オートプハギックとプロテアソームフラックスにおける日のリズムの測定
Summary
オートファジーとマウス肝臓のプロテアソームを介してタンパク質異化の生体リズムを測定するための我々のプロトコルを説明する.
Abstract
細胞は、リソソームおよび非リソソーム経路を含む不要なタンパク質および他の材料をリサイクルするためのいくつかの方法を採用しています。主なリソソーム依存性経路はオートファジーと呼ばれ、タンパク質異化症の主要な非リソソーム法はユビキチンプロテアソーム系である。モデル生物の最近の研究は、オートファジーとユビキチンプロテアソームシステムの両方の活性が一日を通して一定ではなく、代わりに毎日(概日)リズムに応じて変化することを示唆しています。タンパク質回転率の生体リズムを測定する能力は、細胞の品質管理がどのように達成されるかを理解し、目的の特定のタンパク質のダイナミクスを理解するために重要です。ここでは、タンパク質回転率の概日成分を捕捉する生体内でオートプハギックおよびプロテアソームフラックスを定量するための標準化されたプロトコルを提示する。当社のプロトコルには、マウスの取り扱い、組織処理、分画、およびマウス肝臓を出発材料として使用したオートファギックフラックス定量の詳細が含まれています。
Introduction
概日リズムは、自然全体で明らかな生物学的機能の毎日の予測可能な変動を指します。睡眠覚醒サイクルのようなマクロ的な行動から、生体分子のリズミカルな豊富さのような分子現象まで、あらゆる生物学的規模で存在します。近年、概日リズム生成に不可欠な「クロック遺伝子」の発見により、概日リズムの研究が変容しています。クロック遺伝子ノックアウトマウスの研究は、代謝1などのコア細胞プロセスを一時的に組織化する概日リズムの中心的な役割を明らかにした。概日リズムがこれを実現する方法の中で、タンパク質異化に時間構造を与えることによってです。
我々を含むいくつかのグループは、細胞タンパク質異化症、オートファジーおよびユビキチンプロテアソーム系の2つの主要な道が、日次リズム2、3、4、5の対象となることを示している。オートファジーは、目的のタンパク質が新規小胞(マクロオートファジー)の構築を通じて、または直接転移を通じてこの劣化小器官に送達されるタンパク質異化のリソソーム依存性アームを表す。チャネル(シャペロン媒介オートファジー)6.ユビキチン・プロテアソーム系は、タンパク質がポリユビキチン化され、プロテアソームに送り込まれる主要な非リソソーム経路であり、細胞質および核7、8全体で見られる高分子分解機である。オートファジーとプロテアソーム活性のリズムは、細胞のハウスキーピングに役割を果たす可能性が高いので重要です。その結果、前臨床疾患モデルと互換性のあるタンパク質異化の日常的な振動を検出できる標準化された手順を持つことは貴重です。
ここでは、研究室3,9の研究の基礎となっているマウス肝臓のオートファギックフラックスの日常的変動を定量化するためのプロトコルを提供します。我々の方法は、「ターンオーバーアッセイ」10、多くのグループがプロテオ溶解活性(またはフラックス)を測定するために使用されるアプローチとして分類される。このアプローチでは、リソソームまたはプロテアソームに特異的なプロテアーゼ阻害剤をマウスに投与し、その後、組織サンプルが一定の時間間隔後に得られる。並行して、組織サンプルは、シャム注射を行ったマウスから得られる。組織サンプルを均質化し、生化学的に分離し、リソソーム富化および細胞質画分を得る。これらの画分は、マクロオートファジーマーカー(LC3bおよびp62)またはプロテアソーム基質(ポリユビキチン化タンパク質)に特異的な抗体を用いてウェスタンブロッティングを介して並行して分析される。時間が経つにつれて、プロテアーゼ阻害剤を注射された動物は、通常リサイクルされるであろうタンパク質を蓄積します。その結果、ターンオーバー率は、プロテアーゼ阻害剤処理されたサンプル中のマーカータンパク質の豊富さをシャム処理サンプルと比較することによって推測される。この方法を1日を通して一定の時間間隔で繰り返すことにより、プロテオ分解における概日変動を再構築することができる(図1A)。
Protocol
Representative Results
Discussion
我々のプロトコルは、一般的に利用可能な分子生物学装置を使用してマウスのタンパク質回転率の生物学的リズムを測定する技術的に簡単な手段を説明する。時系列実験の長さと関連する生物学的サンプルの数のために、マウスの注入方法、組織獲得のタイミングおよび生化学的処理に関する実験全体で一貫性を保ることが重要である。サンプル。注射、安楽死、頸部脱臼のステップは、本?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、RO1HL135846と児童開発研究所の助成金(PD-II-2016-529)によって資金提供されました。
Materials
| 4x SDS PAGE Sample Buffer | Invitrogen | Cat# NP0008 | |
| Bortezomib | EMD Millipore | Cat# 5.04314.0001; CAS: 179324-69-7 | |
| Image Studio | LICOR | N/A | |
| Immobilon-FL PVDF membrane 0.45 micron | Merck Millipore Ltd | Cat# IPFL00010 | |
| K48-linkage Specific Polyubiquitin (D9D5) Rabbit mAb | Cell Signaling Technology | Cat#8081S; RRID:AB_10859893 | |
| LC3a | Boston Biochem | Cat# UL-430 | |
| LC3b antibody | Novus | Cat#NB100-2220; RRID:AB_10003146 | |
| LC3b antibody | Cell Signaling Technology | Cat#2775; RRID:AB_915950 | |
| Leupeptin | Sigma | Cat# L2884; CAS: 103476-89-7 | |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Midi Protein Gels | Thermo Fisher Scientific | Cat# WG1403BOX | |
| NuPAGE LDS Sample Buffer (4x) | Thermo Fisher Scientific | Cat# NP0007 | |
| P62-his | Novus | Cat# NBP1-44490 | |
| Precision Plus Protein All Blue Prestained Protein Standards | Bio-Rad | Cat# 1610373 | |
| Rabbit Anti-p62/SQSTM1 | Millipore-Sigma | Cat#P0067; RRID:AB_1841064 | |
| rhPoly-Ub WT (2-7) (K48) | Boston Biochem | Cat# UC-230 | |
| SDS-PAGE Midi-size Gels | Invitrogen | Cat# WG1403 | |
| SIGMAFAST Protease Inhibitor Tablets | Millipore-Sigma | Cat# S8830 |
References
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