Måle dagaktive rytmer i Autophagic og proteasomal Flux
Summary
Vi beskriver vår protokoll for måling av biologiske rytmer i protein katabolisme via autofagi og proteasomet i mus leveren.
Abstract
Celler benytter flere metoder for gjenvinning av uønskede proteiner og annet materiale, inkludert lysosomal og ikke-lysosomal veier. Den viktigste lysosome-avhengige stien kalles autofagi, mens den primære ikke-lysosomal metoden for protein katabolisme er ubiquitin-proteasomet systemet. Nyere studier i modell organismer tyder på at aktiviteten til både autofagi og det ubiquitin-proteasomet systemet ikke er konstant over dagen, men i stedet varierer i henhold til en daglig (døgn) rytme. Evnen til å måle biologiske rytmer i protein omsetning er viktig for å forstå hvordan mobil kvalitetskontroll oppnås og for å forstå dynamikken i bestemte proteiner av interesse. Her presenterer vi en standardisert protokoll for kvantifisere autophagic og proteasomal Flux in vivo som fanger opp den biologiske komponenten av protein omsetning. Vår protokoll inneholder detaljer for mus håndtering, vev prosessering, fraksjonering, og autophagic Flux kvantifisering bruker mus leveren som utgangsmaterialet.
Introduction
Døgnrytme refererer til daglige, forutsigbare variasjoner i biologisk funksjon som er åpenbare i naturen. De eksisterer på alle biologiske skala, fra makroskopisk atferd som søvn-våkne sykluser, til molekylære fenomener som rytmisk overflod av biomolekyler. I de senere årene har forskning på døgn rytmer blitt forvandlet av oppdagelsen av “klokke gener” som er avgjørende for generering av døgnrytme. Studier i klokke genet knockout mus har avdekket en sentral rolle for døgnrytme i timelig organisering kjerne cellulære prosesser som metabolisme1. Blant de måtene døgnrytmen gjør dette på, er ved å formidle en timelig struktur til protein katabolisme.
Flere grupper, inkludert vår har vist at de to store veier for mobilnettet protein katabolisme, autofagi og ubiquitin-proteasomet systemet, er underlagt dagaktive rytmer2,3,4,5. Autofagi representerer den lysosome armen av protein katabolisme der proteiner av interesse blir levert til denne degradative organelle enten gjennom byggingen av en roman vesicle (macroautophagy) eller gjennom direkte translokasjon om en kanal (Anstandsdame mediert autofagi)6. Den ubiquitin-proteasomet systemet er den viktigste ikke-lysosomal veien, hvor proteiner er Poly-ubiquitinated og deretter matet inn i proteasomet, en makro molekylære degradative maskin funnet i hele cytoplasma og nucleus7,8. Rytmer i autophagic og proteasomal aktivitet er viktig fordi de sannsynligvis spiller en rolle i mobilnettet housekeeping. Som et resultat, er det verdifullt å ha en standardisert prosedyre som kan oppdage daglig svingninger i protein katabolisme som er kompatibel med pre-klinisk sykdom modeller.
Her gir vi vår protokoll for kvantifisere dagaktive variasjoner i autophagic Flux i mus leveren, som har fungert som grunnlag for arbeid i vårt laboratorium3,9. Vår metode er klassifisert som en “omsetning analysen”10, en tilnærming som brukes av mange grupper for å måle proteolytiske aktivitet (eller Flux). I denne tilnærmingen, protease hemmere spesifikke for lysosomer eller proteasomes administreres til mus og deretter vevsprøver er oppnådd etter en fast tidsintervall. Parallelt er vevsprøver innhentet fra mus utsatt for humbug injeksjoner. Vevsprøvene er homogenisert og deretter biokjemisk separert for å oppnå de lysosome-beriket og cytoplasmatiske fraksjoner. Disse fraksjoner blir deretter analysert parallelt via vestlige blotting ved hjelp av antistoffer som er spesifikke for macroautophagy markører (LC3b og p62) eller proteasomal underlag (Poly-ubiquitinated protein). Over tid, dyr injisert med protease hemmere akkumulere proteiner som normalt ville ha blitt resirkulert. Som et resultat, er frekvensen av omsetningen utledes ved å sammenligne overflod av markør proteiner i protease-hemmere behandlet prøvene til humbug-behandlet prøvene. Ved å gjenta denne metoden ved faste tidsintervaller på dagen er det mulig å rekonstruere døgnvariasjoner i proteinolyse (figur 1a).
Protocol
Representative Results
Discussion
Vår protokoll beskriver en teknisk grei måte å måle biologiske rytmer i protein omsetning i mus ved hjelp av allment tilgjengelig molekylærbiologi utstyr. På grunn av lengden på tidsserien eksperimenter og antall biologiske prøver involvert, er det viktig å være konsekvent på tvers av hele eksperimentet om hvordan musene injiseres, tidspunktet for vev oppkjøp og biokjemiske behandling av Prøver. Trinnene for injeksjon, døds aktiv og cervical forvridning kan kreve operatør praksis før et fullskala eksperim…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble finansiert av RO1HL135846 og en Children ‘ s Development Institute Grant (PD-II-2016-529).
Materials
| 4x SDS PAGE Sample Buffer | Invitrogen | Cat# NP0008 | |
| Bortezomib | EMD Millipore | Cat# 5.04314.0001; CAS: 179324-69-7 | |
| Image Studio | LICOR | N/A | |
| Immobilon-FL PVDF membrane 0.45 micron | Merck Millipore Ltd | Cat# IPFL00010 | |
| K48-linkage Specific Polyubiquitin (D9D5) Rabbit mAb | Cell Signaling Technology | Cat#8081S; RRID:AB_10859893 | |
| LC3a | Boston Biochem | Cat# UL-430 | |
| LC3b antibody | Novus | Cat#NB100-2220; RRID:AB_10003146 | |
| LC3b antibody | Cell Signaling Technology | Cat#2775; RRID:AB_915950 | |
| Leupeptin | Sigma | Cat# L2884; CAS: 103476-89-7 | |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Midi Protein Gels | Thermo Fisher Scientific | Cat# WG1403BOX | |
| NuPAGE LDS Sample Buffer (4x) | Thermo Fisher Scientific | Cat# NP0007 | |
| P62-his | Novus | Cat# NBP1-44490 | |
| Precision Plus Protein All Blue Prestained Protein Standards | Bio-Rad | Cat# 1610373 | |
| Rabbit Anti-p62/SQSTM1 | Millipore-Sigma | Cat#P0067; RRID:AB_1841064 | |
| rhPoly-Ub WT (2-7) (K48) | Boston Biochem | Cat# UC-230 | |
| SDS-PAGE Midi-size Gels | Invitrogen | Cat# WG1403 | |
| SIGMAFAST Protease Inhibitor Tablets | Millipore-Sigma | Cat# S8830 |
References
- Green, C. B., Takahashi, J. S., Bass, J. The meter of metabolism. Cell. 134 (5), 728-742 (2008).
- Ma, B. Y., et al. LPS suppresses expression of asialoglycoprotein-binding protein through TLR4 in thioglycolate-elicited peritoneal macrophages. Glycoconjugate Journal. 24 (4-5), 243-249 (2007).
- Ryzhikov, M., et al. Diurnal Rhythms Spatially and Temporally Organize Autophagy. Cell Reports. 26 (7), 1880-1892 (2019).
- Martinez-Lopez, N., et al. System-wide Benefits of Intermeal Fasting by Autophagy. Cell Metabolism. 26 (6), 856-871 (2017).
- Desvergne, A., et al. Circadian modulation of proteasome activity and accumulation of oxidized protein in human embryonic kidney HEK 293 cells and primary dermal fibroblasts. Free Radical Biology and Medicine. 94, 195-207 (2016).
- Levine, B., Mizushima, N., Virgin, H. W. Autophagy in immunity and inflammation. Nature. 469 (7330), 323-335 (2011).
- Ciechanover, A. Intracellular protein degradation: from a vague idea thru the lysosome and the ubiquitin-proteasome system and onto human diseases and drug targeting. Cell Death & Differentiation. 12 (9), 1178-1190 (2005).
- Collins, G. A., Goldberg, A. L. The Logic of the 26S Proteasome. Cell. 169 (5), 792-806 (2017).
- Haspel, J., et al. Characterization of macroautophagic flux in vivo using a leupeptin-based assay. Autophagy. 7 (6), 629-642 (2011).
- Klionsky, D. J., et al. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy (3rd edition). Autophagy. 12 (1), 1-222 (2016).
- Eckel-Mahan, K., Sassone-Corsi, P. Phenotyping Circadian Rhythms in Mice. Current Protocols in Mouse Biology. 5 (3), 271-281 (2015).
- Hughes, M. E., et al. Guidelines for Genome-Scale Analysis of Biological Rhythms. Journal of Biological Rhythms. 32 (5), 380-393 (2017).
