מדידת פעילות השינואז בדגימות ביולוגיות
Summary
מוצג כאן היא שיטה פשוטה למדוד פעילות chitinase בנוזלים ביולוגיים כגון שאיפה ברונבשיים או סרום.
Abstract
השינוסים הם האנזימים. שקליב כיגין גם בהיעדר כלאין, ממאנים יש כמויות משמעותיות של השטיות הקיימות בגוף, כולל בבסיס. התפקיד המדויק של chitinase אינו ידוע, אולם זה היה האמין לשחק תפקיד חשוב בעיכול והגנה מארחים נגד המזון המכיל מזון פתוגנים, בהתאמה. העבודה האחרונה, כולל שלנו, הראה תפקיד חשוב של מחלת המין הצ והחלבונים בחסינות המארחת ומחלות אלרגיות. חשוב מכך, פעילויות chitinase לשמש בסמנים חשובים של חומרת המחלה במגוון רחב של מחלות כולל סוג 2 מחלות דלקתיות כגון אסטמה פיברוזיס ריאתי. באופן דומה, חולים עם הפרעות גנטיות כמו מחלת Gaucher יש משמעותית רמות chitinase גבוהות, אשר לא רק לתאם עם חומרת המחלה אלא גם לשמש בסמנים אמין עבור יעילות טיפולית. הפרוטוקול המתואר כאן מתאר את הדרך פשוטה, מהירה, וישירה כדי למדוד פעילות chitinase בדגימות בל או סרום של עכברים והוא יכול להיות מותאם באופן נרחב לנושאים בני אדם ואורגניזמים מודל אחרים בשל הטבע שימור מאוד של אנזימים.
Introduction
כיאין הוא הרב ביותר הנפוץ ביותר על פני כדור הארץ לאחר תאית, המשמש כמרכיב המבני העיקרי של מגוון של אורגניזמים כולל שלד חיצוני של חרקים, פטריות, שמרים, אצות; בעלי חוליות מסוימים כוללים גם את הצ1. השינוסים הם משפחה של אנזימים המסוגלים לשבור את הצ ונשמרים מאוד במהלך האבולוציה במינים הנעים מחיידקים ליונקים2,3. בנוסף על כוונון, יונקים יש גם chitinases כמו חלבונים אשר דומים chitinases ביכולתם לאגד כיטין אבל שונים כי הם חסרי יכולת אנזימטית לקליב את הצ’יטוס4.
למרות שצ וכיטיות כבר נחקרו מזמן-בחקירות שראשיתה בתחילת 1900-המוקד העיקרי היה בתפקידם בחרקים ובחסרי חוליות אחרים. למעשה, זה לא היה עד שנות ה-60 כאשר נמצאו בעלי חוליות בכלל. באמצעות שימוש בשיטה המבוססת על צ’יטיואז, הוצגו השינוסים שנמצאו במערכת העיכול של מספר בעלי חוליות, כולל לטאות ועופות שחורות – תצפית המשוערות להיות בשל צריכת האורגניזמים המכילים כגון חרקים5 .
ליונקים יש שני צורות אנזימליות הפעילות של chitinase: מיונקים חומציים (AMCase; הידוע גם בשם CHIT2 ו-CHIA) ו chitotriosidase (CHIT1)4. שני החלבונים הללו מסוגלים. לעשות הידרוליזינג כיגין עם זאת, CHIT1 הוא הפעיל אנזימטי יותר בבני אדם, שם כמעט כל פעילות chitinase נגזרת מ CHIT1. 4 בעכברים, הן Chit1 ו-amcase כמעט באופן שווה לתרום פעילות chitinase הכולל6. מצד שני, חלבונים כמו…
Chit1 מופרש בעיקר על ידי מקרופאגים והוא נחשב לעתים קרובות להיות תגובה חיסונית כאשר המכיל פתוגנים המכילים7. האנזים הוכח גם להיות מעורב בהבשלה של מונוציטים לשני M1 ו M2 מקרופאג תת, גם ללא נוכחות של המצע כיטין8. יתר על כן, זה עשוי להיות גם מעורב בהבשלה של תאים חיסוניים אחרים כולל T מסייע סוג 2 (Th2) תאים ו אאוזינופילים-כפי שהוצג להיות במקרה של זיהום ריאות cryptococcal9. מחקרים אלה מצביעים על תפקיד מורכב של כביסים במערכת החיסונית.
בשנים האחרונות, Chit1 רמות נמצאו לשמש ביוארקר חשוב של התקדמות עבור מעל 40 מחלות אנושיות שונות, כולל מחלות אחסון lysoזומלית, מחלות זיהומיות, מחלות נשימה, מחלות endocrinological, וכלי דם מחלות, מחלות נוירולוגיות ואחרות (נבדקו10). ברבים ממחלות אלה, רמות של Chit1 הם מנבא חזק של חומרת המחלה ואת האפקטיביות הטיפולית10.
כמו chitinases השיגו מוניטין כמו בסמנים עבור מצבים רפואיים רבים כולל מחלת gaucher, כלים בחני פותחו כדי להקל על בדיקות של נוכחות chitinases. שיטות מבוגרות יותר כוללות הליך של Schales, פרוטוקול המותאם מבדיקת הגלוקוז בדם, ואת 3, 5 dinitרוזלין חומצה (DNS) שיטה. עם זאת, שיטות אלה הן לעתים קרובות רגישות הזמן ומבחינה טכנית קשה11. ההליך עבור שני בדיקות אלה דורש הפחתת חמצון אורגניים, ferricyanide במקרה של ההליך של Schales למשל, הפקת שינוי צבע כי ניתן רק למדוד spectrophotometrically. בנוסף, שתי הבדיקות כרוכות בחימום או בצעד רותח שהוא זמן רב והכרחי לצבע לפתח12,13.
המתואר כאן הוא שיטה מהירה ופשוטה פלוורימטרית כדי לקבוע רמות של צ’יטאנאז בדגימות של ממיונקים14,15. שניים מהדגימות המשמשות כאן כוללות ששטיפה סרום וברונשיים (BAL); פעילות chitinase נמדדה גם בדגימות חלב ושתן, וניתן לבצע את הטכניקה בסוג זה של דגימות כמו גם בכל נוזל ביולוגי אחר16,17.
Protocol
Representative Results
Discussion
הפעילות chitinase התפתחה בתור בסמנים חשוב לניבוי חומרת המחלה, התקדמות המחלה, היעילות הטיפולית ואת הנוכחות של פתוגנים ספציפיים18. למרות שרבות מן התיאוריות הארוכות-היסוד בנוגע לתפקיד השינוסים לא הוכחו בניסויים בגיל19, מחקרים חדשים סיפקו תובנות חשובות לתפקיד השינוסים ו?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה היה נתמך על ידי האגודה האמריקנית לריאות ופרסים האגודה האמריקנית לתרבות החזה LS. מחברים בכנות רוצה להודות ד ר ג ‘ ק אליאס וד ר צ’ון Geun לי על מתן זנים העכבר הטרנסגניים.
Materials
| 4-methylumbelliferone | Sigma | M1381 | Standard: commonly used in flourimetric assays for determination of enzyme activity |
| 4MU-GlcNAc2 | Sigma | M9763 | fluorescent chitinase substrate for use in mouse samples |
| 4MU-GlcNAc3 | Sigma | M5639 | fluorescent chitinase substrate for use in human samples |
| Citric Acid-monohydrate | for use in McIlvain Buffer | ||
| Glycine | for use in Stop Buffer at a concentration of 0.3 M | ||
| Na2HPO4xH2O | for use in McIlvain Buffer | ||
| NaOH | for use in Stop Buffer at a concentration of 12 g/L | ||
| Vision Plate: Non-sterile, untreated black 96 well plate | 4titude | 4ti-0224 |
References
- Hamid, R., Khan, M. A., Ahmad, M. Chitinases: An update. Journal of Pharmacy and Bioallied Sciences. 5 (1), 21-29 (2013).
- Sharma, L., et al. Regulation and Role of Chitotriosidase during Lung Infection with Klebsiella pneumoniae. Journal of Immunology. 201 (2), 615-626 (2018).
- Kanneganti, M., Kamba, A., Mizoguchi, E. Role of chitotriosidase (chitinase 1) under normal and disease conditions. Journal of Epithelial Biology & Pharmacology. 5, 1-9 (2012).
- Lee, C. G., et al. Role of Chitin and Chitinase/Chitinase-Like Proteins in Inflammation, Tissue Remodeling, and Injury. Annual Review of Physiology. (73), 479-501 (2011).
- Jeuniaux, C. Chitinase: An Addition to the List of Hydrolases in the Digestive Tract of Vertebrates. Nature. 192 (4798), 135-136 (1961).
- Boot, R. G., et al. Identification of a Novel Acidic Mammalian Chitinase Distinct from Chitotriosidase. Journal of Biological Chemistry. 276 (9), 6770-6778 (2000).
- Arndt, S., Hobbs, A., Sinclaire, I., Lane, A. B. Chitotriosidase Deficiency: A Mutation Update in an African Population. JIMD Reports. 10, 11-16 (2013).
- Di Rosa, M., Malaguarnera, G., De Gregorio, C., Drago, F., Malaguarnera, L. Evaluation of CHI3L-1 and CHIT-1 Expression in Differentiated and Polarized Macrophages. Inflammation. 36 (2), 482-492 (2013).
- Wiesner, D. L., et al. Chitin Recognition via Chitotriosidase Promotes Pathologic Type-2 Helper T Cell Responses to Cryptococcal Infection. PLOS Pathogens. 11 (3), e1004701 (2015).
- Elmonem, M. A., vanden Heuvel, L. P., Levtchenko, E. N. Immunomodulatory Effects of Chitotriosidase Enzyme. Enzyme Research. 2016, 1-9 (2016).
- Ferrari, A. R., Gaber, Y., Fraaije, M. W. A fast, sensitive and easy colorimetric assay for chitinase and cellulase activity detection. Biotechnol Biofuels. 7 (37), 1-8 (2014).
- Schales, O., Schales, S. S. Simple method for the determination of glucose in blood. Proc Am Fed Clin Res. 2, 78 (1945).
- Zarei, M., et al. Characterization of Chitinase with Antifungal Activity from a Native Serratia Marcescens B4A. Brazilian Journal of Microbiology. 42 (297), 1017-1029 (2011).
- Zhu, Z., et al. Acidic Mammalian Chitinase in Asthmatic Th2 Inflammation and IL-13 Pathway Activation. Science. 304 (5677), 1678-1682 (2004).
- Hollak, C. E., van Weely, S., van Oers, M. H., Aerts, J. M. Marked elevation of plasma chitotriosidase activity. A novel hallmark of Gaucher disease. Journal of Clinical Investigation. 93 (3), 1288-1292 (1994).
- Musumeci, M., Malaguarnera, L., Simpore, J., Barone, R., Whalen, M., Musumeci, S. Chitotriosidase activity in colostrum from African and Caucasian women. Clinical Chemistry and Laboratory. 43 (2), 198-201 (2005).
- Maddens, B., et al. Chitinase-like Proteins are Candidate Biomarkers for Sepsis-induced Acute Kidney Injury. Mol Cell Proteomics. 11, 1-13 (2012).
- Hector, A., et al. Chitinase activation in patients with fungus-associated cystic fibrosis lung disease. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 138 (4), 1183-1189 (2016).
- Hall, A. J., Morroll, S., Tighe, P., Götz, F., Falcone, F. H. Human chitotriosidase is expressed in the eye and lacrimal gland and has an antimicrobial spectrum different from lysozyme. Microbes and Infection. 10 (1), 69-78 (2008).
- Kim, L. K., et al. AMCase is a crucial regulator of type 2 immune responses to inhaled house dust mites. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (22), e2891-e2899 (2015).
- Olkhovych, N. V. Chitotriosidase activity as additional biomarker in the diagnosis of lysosomal storage diseases. Ukrainian Biochemical Journal. 88 (1), 69-78 (2016).
- Bouayadi, O., et al. Disease: An Underdiagnosed Pathology in the Eastern Moroccan Population. eJIFCC. 30 (1), 82-87 (2019).
- Tasci, C., et al. Efficacy of serum chitotriosidase activity in early treatment of patients with active tuberculosis and a negative sputum smear. Therapeutics and Clinical Risk Management. 8, 369-372 (2012).
- Barone, R., Simporé, J., Malaguarnera, L., Pignatelli, S., Musumeci, S. Plasma chitotriosidase activity in acute Plasmodium falciparum malaria. Clinica Chimica Acta. 331 (1-2), 79-85 (2003).
- Kitamoto, S., et al. Chitinase inhibition promotes atherosclerosis in hyperlipidemic mice. American Journal of Pathology. 183 (1), 313-325 (2013).
- Kzhyshkowska, J., Gratchev, A., Goerdt, S. Human Chitinases and Chitinase-Like Proteins as Indicators for Infl Ammation and Cancer. Biomark Insights. 2, 128-146 (2007).
