Misurazione dell'attività della chitinasi nei campioni biologici

Summary

Presentato qui è un metodo semplice per misurare l’attività delle chitinasi nei fluidi biologici come la lavanda bronchoalveolare o il siero.

Abstract

Le chitinasi sono gli enzimi che fendono la chitina. Anche in assenza di chitina, i mammiferi hanno quantità significative di chitinasi presenti nel corpo anche al basale. Il ruolo preciso della chitinasi non è noto, tuttavia si credeva che svolgesse un ruolo importante nella digestione e nella difesa dell’ospite contro il cibo e gli agenti patogeni che contengono la chitina, rispettivamente. Recenti lavori, tra cui il nostro, hanno mostrato un ruolo importante della chitinasi e delle proteine simili alla chitinasi nell’immunità dell’ospite e nelle malattie allergiche. È importante sottolineare che le attività di chitinasi fungono da importanti biomarcatori della gravità della malattia in un’ampia gamma di malattie, tra cui malattie infiammatorie di tipo 2 come l’asma e la fibrosi polmonare. Allo stesso modo, i pazienti con disturbi genetici come la malattia di Gaucher hanno livelli di chitinasi significativamente elevati, che non solo correlano con la gravità della malattia, ma servono anche come un biomarcatore affidabile per l’efficacia terapeutica. Il protocollo qui descritto descrive un modo semplice, rapido e diretto per misurare l’attività delle chitinasi in campioni di BAL o siero di topi e può essere ampiamente adattato a soggetti umani e altri organismi modello a causa della natura altamente conservata degli enzimi.

Introduction

La chitina è il secondo polisaccaride più abbondante sulla terra dopo la cellulosa, servendo come componente strutturale principale di una varietà di organismi tra cui l’esoscheletro di insetti, funghi, lieviti e alghe; alcuni vertebrati hanno anche la chitina¹. Le chitinasi sono una famiglia di enzimi che sono in grado di abbattere la chitina e sono altamente conservati durante tutta l’evoluzione in specie che vanno dai batteri ai mammiferi^2,3. Oltre alle chitinasi, i mammiferi hanno anche proteine simili alla chitinasi che sono simili alle chitinasi nella loro capacità di legare la chitina, ma differiscono in quanto mancano di capacità enzimatica di fendere la chitina^{4 .}

Anche se le chitine e le chitinasi sono state studiate da tempo, con indagini risalenti ai primi anni del 1900, l’attenzione principale è stata sul loro ruolo negli insetti e in altri invertebrati. Infatti, non è stato fino al 1960, quando i vertebrati sono stati trovati ad avere chitinasi a tutti. Utilizzando un saggio a base di chitobiasi, è stato dimostrato che le chitinasi si trovano nel tratto digestivo di un certo numero di vertebrati, tra cui lucertole e merli, un’osservazione ipotizzata sia dovuta al consumo di organismi contenenti chitina come gli insetti⁵ .

I mammiferi hanno due forme enzimaticamente attive di chitinasi: chitinasi dei mammiferi acidi (AMCase, noti anche come CHIT2 e CHIA) e chitotriosidasi (CHIT1)⁴. Entrambe queste proteine sono in grado di chitina idrolmente. Tuttavia, CHIT1 è più enzimaticamente attivo negli esseri umani, dove quasi tutta l’attività della chitinasi è derivata da CHIT1. ⁴ Nei topi, sia Chit1 che AMCase contribuiscono quasi equamente all’attività complessiva della chitinasi⁶. D’altra parte, le proteine simili alle chitinasi non hanno attività di chitinasi.

Chit1 è principalmente secreto dai macrofagi ed è spesso considerato una risposta immunitaria agli agenti patogeni contenenti chitina⁷. È stato anche dimostrato che l’enzima è coinvolto nella maturazione dei monociti in sottotipi di macrofagio M1 e M2, anche senza la presenza del substrato chitina⁸. Inoltre, può anche essere coinvolto nella maturazione di altre cellule immunitarie tra cui cellule T helper di tipo 2 (Th2) ed eosinofili, come è stato dimostrato di essere il caso in infezione polmonare criptococcale⁹. Questi studi indicano un ruolo complesso delle chitinasi nel sistema immunitario.

Negli ultimi anni, i livelli di Chit1 sono stati trovati come un importante biomarcatore della progressione per oltre 40 diverse malattie umane, tra cui malattie da accumulo lisosomiale, malattie infettive, malattie respiratorie, malattie endocrinologiche, malattie cardiovascolari malattie neurologiche e altre (riviste¹⁰). In molte di queste malattie, i livelli di Chit1 sono un forte predittore di gravità della malattia e l’efficacia terapeutica¹⁰.

Come chitinasi hanno guadagnato una reputazione come biomarcatore per numerose condizioni mediche tra cui malattia di Gaucher, strumenti e saggi sono stati sviluppati per facilitare i test per la presenza di chitinasi. I metodi più vecchi includono la procedura di Schales, un protocollo adattato da un test della glicemia e il metodo 3,5 dell’acido dinitrosalicilico (DNS). Tuttavia, questi metodi sono spesso sensibili al tempo e tecnicamente difficili¹¹. La procedura per entrambi questi test richiede la riduzione di ossidanti inorganici, ferricianide nel caso della procedura di Schales, ad esempio, producendo un cambiamento di colore che può essere misurato solo spettrofotometricamente. Inoltre, entrambi i test comportano una fase di riscaldamento o ebollizione che richiede tempo e necessaria per lo sviluppo del colore^12,13.

Descritto qui è un rapido e semplice saggio fluorimetrico per determinare i livelli di chitinasi nei campioni di mammiferi^14,15. Due dei campioni qui utilizzati includono fluidi di lavaggio del siero e del bronchoalveolar (BAL); L’attività della chitinasi è stata misurata anche in campioni di latte materno e urina, e la tecnica può essere eseguita in quel tipo di campioni così come in qualsiasi altro fluido biologico^16,17.

Protocol

Tutte le procedure sugli animali sono state eseguite nell’ambito di un protocollo approvato dall’IACUC presso la Yale University School of Medicine. 1. Collezione di campioni di mouse Anestesizzazione Anestesizza reati con ketamina e xylazina (100 mg/kg di ketamina e 10 mg/kg di xilanina). Raccolta di campioni di sangue Confermare la profondità dell’anestesia per non risposta a un pizzico di dita dei dei …

Representative Results

I risultati mostrati di seguito provengono da uno studio che misura l’attività della chitinasi nei campioni di siero e BAL di tipo selvatico (C57BL/6) e topi transgenici Chit1 (su sfondo C57BL/6) che sovraesprimono il gene Chit1 su un promotore di doxyciclina. I nostri dati mostrano che sia i campioni di siero che di BAL hanno attività di chitinasi rilevabili in base alla linea di base 698,2 x 189,9 nmol/mL-h e 485,7 x 114 nmol/ml-h, rispettivamente. La sovraespressione del gene Chit1 che utilizza la doxycycline nell’a…

Discussion

L’attività della chitinasi è emersa come un importante biomarcatore per prevedere la gravità della malattia, la progressione della malattia, l’efficacia terapeutica e la presenza di specifici patogeni¹⁸. Anche se molte delle teorie a lungo postulate sul ruolo delle chitinasi non sono state provate sperimentalmente¹⁹, nuovi studi hanno fornito importanti informazioni sul ruolo delle chitinasi e della chitinasi come proteine in varie malattie^2,…

Materials

4-methylumbelliferone	Sigma	M1381	Standard: commonly used in flourimetric assays for determination of enzyme activity
4MU-GlcNAc2	Sigma	M9763	fluorescent chitinase substrate for use in mouse samples
4MU-GlcNAc3	Sigma	M5639	fluorescent chitinase substrate for use in human samples
Citric Acid-monohydrate			for use in McIlvain Buffer
Glycine			for use in Stop Buffer at a concentration of 0.3 M
Na2HPO4xH2O			for use in McIlvain Buffer
NaOH			for use in Stop Buffer at a concentration of 12 g/L
Vision Plate: Non-sterile, untreated black 96 well plate	4titude	4ti-0224