بروتوكول إزالة الميكروسيرس من الليزر الذي ينتج RNA عالي الجودة من عظام الماوس الطازجة المجمدة
Summary
تم تطوير بروتوكول احتجاز الليزر microdissection (LCM) للحصول على كمية كافية من الحمض النووي الريبي عالي الجودة لتحليل التعبير الجيني في خلايا العظام. وتركز الدراسة الحالية على أقسام عظم الفخذ الماوس. ومع ذلك، يمكن استخدام بروتوكول LCM المبلغ عنه هنا لدراسة التعبير الجيني في الخلايا من أي أنسجة صلبة.
Abstract
[رنا] عائد ة ونزاهة حاسمة ل [رنا] تحليل. ومع ذلك، غالباً ما يكون من الصعب من الناحية الفنية للحفاظ على سلامة الحمض النووي الريبي في جميع أنحاء كامل ليزر التقاط microdissection (LCM) الإجراء. بما أنّ [لكم] دراسات يعمل مع [لوو كمّوتس] المادة, اهتمامات حول محدودة [رنا] غلة أيضا مهمّة. ولذلك، تم تطوير بروتوكول LCM للحصول على كمية كافية من الحمض النووي الريبي عالية الجودة لتحليل التعبير الجيني في خلايا العظام. تم تقييم تأثير بروتوكول تلطيخ، وسمك التبريد، وكمية الأنسجة المجهرية، ومجموعة استخراج الحمض النووي الريبي، ونظام LCM المستخدمة في العائد RNA والسلامة التي تم الحصول عليها من خلايا العظام microdissected. تم إجراء ثمانية ميكرومتر سميكة أقسام العظام المجمدة باستخدام فيلم لاصق وملطخة باستخدام بروتوكول سريع لوصمة عار LCM التجارية. كانت العينة تقع بين غشاء تيريفثالات البولي إثيلين (PET) والفيلم اللاصق. وقد استخدم نظام LCM يستخدم الجاذبية لجمع العينات وطريقة استخراج الحمض النووي الريبي المستندة إلى العمود للحصول على RNAs عالية الجودة ذات العائد الكافي. وتركز الدراسة الحالية على أقسام عظم الفخذ الماوس. ومع ذلك، يمكن استخدام بروتوكول LCM المبلغ عنه هنا لدراسة التعبير الجيني في الموقع في الخلايا من أي أنسجة صلبة في كل من الظروف الفسيولوجية وعمليات المرض.
Introduction
تتكون الأنسجة من أنواع الخلايا غير المتجانسة والموزعة مكانياً. قد تستجيب أنواع الخلايا المختلفة في نسيج معين بشكل مختلف لنفس الإشارة. ولذلك، فمن الضروري أن تكون قادرة على عزل مجموعات محددة من الخلايا لتقييم دور أنواع الخلايا المختلفة في كل من الظروف الفسيولوجية والمرضية. يوفر استئصال الليزر الجزئي (LCM) طريقة سريعة ودقيقة نسبيًا لعزل وإزالة خلايا محددة من الأنسجة المعقدة1. تستخدم أنظمة LCM قوة شعاع الليزر لفصل الخلايا ذات الأهمية عن أقسام الأنسجة النسيجية دون الحاجة إلى المعالجة الأنزيمية أو النمو في الثقافة. وهذا يعني أن الخلايا في موطن الأنسجة الطبيعية، وأنه يتم الاحتفاظ بنية الأنسجة بما في ذلك العلاقة المكانية بين الخلايا المختلفة. يتم الحفاظ على مورفولوجيا كل من الخلايا التي تم التقاطها والأنسجة المتبقية بشكل جيد، ويمكن أخذ عينات من العديد من مكونات الأنسجة بالتتابع من نفس الشريحة. ويمكن بعد ذلك استخدام الخلايا المعزولة للتحليل اللاحق لمحتوى الحمض النووي الريبي أو الحمض النووي أو البروتين أو المستقلب2و3.
من أجل تحليل التعبير الجيني في مختلف مجموعات الخلايا، أو بعد علاجات مختلفة، فمن الضروري الحصول على mRNAs من نوعية وكمية كافية للتحليل اللاحق4،5. على النقيض من الحمض النووي، RNAs هي أكثر حساسية للتثبيت ويوصى باستخدام الأنسجة المجمدة عندما يكون الهدف هو دراسة الحمض النووي الريبي. وبما أن هذه الحالات تتدهور بسرعة بسبب الريبونوكليس (RNase) في كل مكان، فإن هناك حاجة إلى شروط صارمة خالية من RNase أثناء مناولة العينات وإعدادها وتجنب تخزين العينات في درجة حرارة الغرفة. وبالإضافة إلى ذلك، فإن التقنيات السريعة دون أي خطوات مرحلة مائية طويلة هي حاسمة لمنع تدهور الحمض النووي الريبي6. ويمكن أيضا أن تتأثر العائد RNA والنزاهة من قبل عملية LCM ونظام LCM المستخدمة7،8. حاليا، أربعة أنظمة LCM مع مبادئ التشغيل المختلفة متاحة2. طريقة استخراج الحمض النووي الريبي يمكن أيضا أن تكون مهمة، منذ تم اختبار مجموعات العزل RNA مختلفة مع اختلافات كبيرة في كمية الحمض النووي الريبي ونوعية7،8.
أي طريقة لإعداد الأنسجة تتطلب إيجاد توازن بين الحصول على تباين مورفولوجي جيد والحفاظ على سلامة الحمض النووي الريبي لمزيد من التحليلات. لإعداد أقسام المجمدة من العظام، تم تطوير فيلم لاصق وتحسينها باستمرار9. يتم قطع أقسام العظام وملطخة مباشرة على فيلم لاصق. هذا الفيلم لاصق ينطبق على العديد من أنواع تلطيخ، ويمكن استخدامها لعزل الخلايا ذات الفائدة من استئصال التبريد العظام باستخدام LCM9،10،11،12،13، 14. جميع الخطوات بما في ذلك الإزالة الجراحية، والتضمين، وتجميد، وقطع وتلطيخ يمكن أن تكتمل في أقل من ساعة واحدة. الأهم من ذلك، يمكن تحديد الخلايا مثل osteoblasts، خلايا بطانة العظام، وosteoclasts بوضوح9،10،11، 12،13،14. هذه الطريقة لديها ميزة كونها سريعة وبسيطة. وهناك طريقة بديلة لتوليد العظام التبريد هو استخدام نظام نقل الشريط15. ومع ذلك، فإن هذه التقنية الأخيرة هي أكثر استهلاكا للوقت وتتطلب أجهزة إضافية، حيث أن الأقسام يجب أن تنقل من شريط لاصق على الشرائح غشاء المغلفة مسبقا عن طريق الأشعة فوق البنفسجية (الأشعة فوق البنفسجية) عبر الربط. على الرغم من أن نظام نقل الشريط قد اقترن بنجاح مع LCM16،17،18،19،تجدر الإشارة إلى أن طلاء عبر مرتبطة يمكن أن تخلق نمط الخلفية التي يمكن أن تتداخل مع خلية من نوع تعريف20.
عادة، يتم استخراج كميات صغيرة فقط من الحمض النووي الريبي من الخلايا المجهرية، وغالبا ما يتم تقييم نوعية وكمية الحمض النووي الريبي بواسطة الكهربائي الشعيرات الدقيقة21. يتم استخدام برنامج كمبيوتر لتعيين فهرس الجودة لمقتطفات RNA يسمى رقم تكامل RNA (RIN). تشير قيمة RIN البالغة 1.0 إلى الحمض النووي الريبي المتدهور تمامًا، بينما تشير قيمة 10.0 إلى أن الحمض النووي الريبي سليم تمامًا22. عادة, اعتبرت فهرسات على 5 كاف ل [رنا] دراسات. وقد تم الإبلاغ عن أنماط التعبير الجيني في عينات تبلغ قيمتها RIN 5.0-10.0 لترتبط بشكل جيد مع بعضها البعض23. على الرغم من أن حساسية هذه الطريقة عالية، حيث يمكن الكشف عن أقل من 50 pg/μL من إجمالي الحمض النووي الريبي، فإنه يمكن أن يكون من الصعب جدا الحصول على تقييم الجودة إذا كان تركيز الحمض النووي الريبي في العينة منخفض جدا. لذلك، من أجل تقييم جودة الحمض النووي الريبي، وغالبا ما يستخدم قسم الأنسجة المتبقية بعد LCM لاستخراج RNA، عن طريق أنبوب العازلة على الشريحة24.
على الرغم من أن LCM قد استخدمت على نطاق واسع على أنسجة مجمدة مختلفة، نادرا ما يتم الإبلاغ عن قيم RIN من RNAs المستخرجة. وعلاوة على ذلك، لا توجد دراسات مقارنة لتوضيح الطريقة الأنسب لدراسة الحمض النووي الريبي في عظام الماوس. في هذه الدراسة، تم استخدام أقسام مجمدة من عظم الفخذ الماوس الكبار لتحسين إعداد العينة، بروتوكول LCM واستخراج الحمض النووي الريبي من أجل الحصول على جودة عالية RNAs. وقد تم تحسين هذا البروتوكول بشكل خاص بالنسبة لنظام LCM الذي يستخدم الجاذبية لجمع العينات.
Protocol
Representative Results
Discussion
يمكن أن تتأثر كل من نوعية وكمية الحمض النووي الريبي سلبا في جميع مراحل إعداد العينة مثل التلاعب في الأنسجة، عملية LCM، واستخراج الحمض النووي الريبي. ولذلك، تم تطوير بروتوكول LCM للحصول على كمية كافية من الحمض النووي الريبي عالية الجودة لتحليل التعبير الجيني اللاحقة.
بالنسبة ل…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ويشكر المؤلفان أوتي زيتز ونيكول جينر على مساعدتهما التقنية الممتازة، فضلاً عن موظفي فيتكور ومراقبة الحيوانات على دعمهما.
Materials
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | 63689-25ML-F | |
| Absolute ethanol EMPLURA | Merck Millipore | 8,18,76,01,000 | |
| Adhesive film (LMD film) | Section-Lab | C-FL001 | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer System | Agilent Technologies | ||
| Agilent RNA 6000 Pico Chip Kit | Agilent Technologies | 5067-1513 | |
| Arcturus HistoGene Staining Solution | Applied Biosystems | 12241-05 | |
| Cryofilm fitting tool | Section-Lab | C-FT000 | |
| Cryostat Leica CM 1950 | Leica Biosystems | ||
| glass microscope slides, cut colour frosted orange | VWR Life Science | 631-1559 | |
| Histology tissue molds PVC | MEDITE | 48-6302-00 | |
| LMD7 Laser Mikrodissektion System | Leica Microsystems | ||
| Low profile Microtome Blades Leica DB80 XL | Leica Biosystems | 14035843496 | |
| Nuclease-free water | VWR Life Science | E476-500ML | |
| PET membrane slides 1.4 mircon | Molecular Machines & Industries GmbH | 50102 | |
| RNase Away surface decontaminant | Molecular BioProduct | 7002 | |
| RNeasy Micro Kit | Qiagen | 74004 | |
| Tissue-Tek optimal cutting temperature (OCT) compound | Sakura Finetek | 4583 | |
| Xylene | VWR Life Science | 2,89,73,363 |
References
- Emmert-Buck, M. R., et al. Laser capture microdissection. Science. 274 (5289), 998-1001 (1996).
- Legres, L. G., Janin, A., Masselon, C., Bertheau, P. Beyond laser microdissection technology: follow the yellow brick road for cancer research. American journal of Cancer Research. 4 (1), 1-28 (2014).
- Datta, S., et al. Laser capture microdissection: Big data from small samples. Histology and histopathology. 30 (11), 1255-1269 (2015).
- Kerman, I. A., Buck, B. J., Evans, S. J., Akil, H., Watson, S. J. Combining laser capture microdissection with quantitative real-time PCR: effects of tissue manipulation on RNA quality and gene expression. Journal of Neuroscience Methods. 153 (1), 71-85 (2006).
- Adiconis, X., et al. Comparative analysis of RNA sequencing methods for degraded or low-input samples. Nature Methods. 10 (7), 623-629 (2013).
- Golubeva, Y. G., Warner, A. C. Laser Microdissection Workflow for Isolating Nucleic Acids from Fixed and Frozen Tissue Samples. Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 1723, 33-93 (2018).
- Farris, S., Wang, Y., Ward, J. M., Dudek, S. M. Optimized Method for Robust Transcriptome Profiling of Minute Tissues Using Laser Capture Microdissection and Low-Input RNA-Seq. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 185 (2017).
- Garrido-Gil, P., Fernandez-Rodríguez, P., Rodríguez-Pallares, J., Labandeira-Garcia, J. L. Laser capture microdissection protocol for gene expression analysis in the brain. Histochemistry and Cell Biology. 148 (3), 299-311 (2017).
- Kawamoto, T., Kawamoto, K. Preparation of thin frozen sections from nonfixed and undecalcified hard tissues using Kawamot’s film method. Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 1130, 149-164 (2014).
- Streicher, C., et al. Estrogen Regulates Bone Turnover by Targeting RANKL Expression in Bone Lining Cells. Scientific Reports. 7 (1), 6460 (2017).
- Vaidya, M., et al. Osteoblast-specific overexpression of amphiregulin leads to transient increase in femoral cancellous bone mass in mice. Bone. 81, 36-46 (2015).
- Jay, F. F., et al. Amphiregulin lacks an essential role for the bone anabolic action of parathyroid hormone. Molecular and Cellular Endocrinology. 417, 158-165 (2015).
- Murali, S. K., Andrukhova, O., Clinkenbeard, E. L., White, K. E., Erben, R. G. Excessive Osteocytic Fgf23 Secretion Contributes to Pyrophosphate Accumulation and Mineralization Defect in Hyp Mice. PLoS Biology. 14 (4), e1002427 (2016).
- Andrukhova, O., Schüler, C., Bergow, C., Petric, A., Erben, R. G. Augmented Fibroblast Growth Factor-23 Secretion in Bone Locally Contributes to Impaired Bone Mineralization in Chronic Kidney Disease in Mice. Frontiers in Endocrinology. 9, 311 (2018).
- Golubeva, Y. G., Smith, R. M., Sternberg, L. R. Optimizing Frozen Sample Preparation for Laser Microdissection: Assessment of CryoJane Tape-Transfer System®. PLoS ONE. 8 (6), e66854 (2013).
- Pacheco, E., Hu, R., Taylor, S. Laser Capture Microdissection and Transcriptional Analysis of Sub-Populations of the Osteoblast Lineage from Undecalcified Bone. Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 1723, 191-202 (2018).
- Nioi, P., et al. Transcriptional Profiling of Laser Capture Microdissected Subpopulations of the Osteoblast Lineage Provides Insight Into the Early Response to Sclerostin Antibody in Rats. Journal of Bone and Mineral Research. 30 (8), 1457-1467 (2015).
- Taylor, S., et al. Differential time-dependent transcriptional changes in the osteoblast lineage in cortical bone associated with sclerostin antibody treatment in ovariectomized rats. Bone Reports. 8, 95-103 (2018).
- Taylor, S., et al. Time-dependent cellular and transcriptional changes in the osteoblast lineage associated with sclerostin antibody treatment in ovariectomized rats. Bone. 84, 148-159 (2016).
- Martin, L. B. B., et al. Laser microdissection of tomato fruit cell and tissue types for transcriptome profiling. Nature Protocols. 11 (12), 2376-2388 (2016).
- Imbeaud, S., et al. Towards standardization of RNA quality assessment using user-independent classifiers of microcapillary electrophoresis traces. Nucleic Acids Research. 33 (6), e56 (2005).
- Schroeder, A., et al. The RIN: an RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements. BMC Molecular Biology. 7, 3 (2006).
- Gallego Romero, I., Pai, A. A., Tung, J., Gilad, Y. RNA-seq: impact of RNA degradation on transcript quantification. BMC Biology. 12, 42 (2014).
- Bevilacqua, C., Makhzami, S., Helbling, J. C., Defrenaix, P., Martin, P. Maintaining RNA integrity in a homogeneous population of mammary epithelial cells isolated by Laser Capture Microdissection. BMC Cell Biology. 11, 95 (2010).
- Mahalingam, M., Murray, G. I. Laser Capture Microdissection: Insights into Methods and Applications. Laser Capture Microdissection: Methods and Protocols. , 1-17 (2018).
- Burgemeister, R., Gangnus, R., Haar, B., Schütze, K., Sauer, U. High quality RNA retrieved from samples obtained by using LMPC (laser microdissection and pressure catapulting) technology. Pathology, Research and Practice. 199 (6), 431-436 (2003).
- Cummings, M., et al. A robust RNA integrity-preserving staining protocol for laser capture microdissection of endometrial cancer tissue. Analytical Biochemistry. 416 (1), 123-125 (2011).
- Clément-Ziza, M., Munnich, A., Lyonnet, S., Jaubert, F., Besmond, C. Stabilization of RNA during laser capture microdissection by performing experiments under argon atmosphere or using ethanol as a solvent in staining solutions. RNA. 14 (12), 2698-2704 (2008).
- Kölble, K. The LEICA microdissection system: design and applications. Journal of Molecular Medicine. 78 (7), B24-B25 (2000).
- Böhm, M., Wieland, I., Schütze, K., Rübben, H. Microbeam MOMeNT: non-contact laser microdissection of membrane-mounted native tissue. The American Journal of Pathology. 151 (1), 63-67 (1997).
- Micke, P., et al. A fluid cover medium provides superior morphology and preserves RNA integrity in tissue sections for laser microdissection and pressure catapulting. The Journal of Pathology. 202 (1), 130-138 (2004).
