신선 냉동 마우스 뼈에서 고품질 RNA를 생성하는 레이저 캡처 미세 해부 프로토콜
Summary
레이저 포획 미세해부(LCM) 프로토콜은 골세포의 유전자 발현 분석을 위한 고품질 RNA의 충분한 양을 얻기 위해 개발되었다. 현재 연구는 마우스 대퇴골 섹션에 초점을 맞추고. 그러나, 여기에 보고된 LCM 프로토콜은 임의의 경조직의 세포에서 유전자 발현을 연구하는데 사용될 수 있다.
Abstract
RNA 수율 및 무결성은 RNA 분석에 결정적입니다. 그러나, 전체 레이저 포획 미세 해부 (LCM) 절차를 통해 RNA 무결성을 유지하는 것은 종종 기술적으로 도전적이다. LCM 연구는 낮은 양의 물질로 작동하기 때문에 제한된 RNA 수율에 대한 우려도 중요합니다. 따라서, LCM 프로토콜은 뼈 세포에서 유전자 발현 분석을 위한 고품질 RNA의 충분한 양을 얻기 위하여 개발되었다. 염색 프로토콜, 저온절의 두께, 미세 해부된 조직 수량, RNA 추출 키트 및 미세 해부된 골세포로부터 얻어진 RNA 수율 및 무결성에 사용되는 LCM 시스템의 효과를 평가하였다. 8 μm 두께의 냉동 뼈 섹션은 점착필름을 사용하여 만들어졌고 상업적인 LCM 얼룩에 대한 신속한 프로토콜을 사용하여 염색되었다. 샘플을 폴리에틸렌 테레프탈레이트(PET) 멤브레인과 접착제 막 사이에 끼워 넣은 것이다. 샘플 수집및 컬럼 기반 RNA 추출 방법에 중력을 사용하는 LCM 시스템을 사용하여 충분한 수율의 고품질 RNA를 획득했습니다. 현재 연구는 마우스 대퇴골 섹션에 초점을 맞추고. 그러나, 여기에 보고된 LCM 프로토콜은 생리적 조건 및 질병 과정 모두에서 임의의 경조직의 세포에서 의학적 유전자 발현을 연구하는데 사용될 수 있다.
Introduction
조직은 이기종적이고 공간적으로 분포된 세포 유형으로 구성됩니다. 주어진 조직에 있는 다른 세포 모형은 동일 신호에 다르게 반응할 수 있습니다. 따라서, 생리적 및 병리학적 조건 모두에서 상이한 세포 유형의 역할을 평가하기 위해 특정 세포 집단을 분리할 수 있는 것이 필수적이다. 레이저 포획 미세 해부 (LCM)는 복잡한 조직1에서지정된 세포를 분리하고 제거하는 비교적 빠르고 정확한 방법을 제공합니다. LCM 시스템은 레이저 빔의 힘을 사용하여 세포가 조직학적 조직 섹션에서 관심 있는 세포를 분비처리하거나 배양성장을 할 필요 없이 분리합니다. 이것은 세포가 그들의 자연적인 조직 서식지에 있고, 다른 세포 사이 공간 관계를 포함하는 조직 건축이 유지된다는 것을 의미합니다. 포획된 세포와 잔류 조직의 형태는 잘 보존되고, 여러 조직 성분은 동일한 슬라이드로부터 순차적으로 샘플링될 수 있다. 단리된 세포는 그들의 RNA, DNA, 단백질 또는 대사산물함량2,3의후속 분석을 위해 사용될 수 있다.
상이한 세포 집단에서 유전자 발현을 분석하기 위해, 또는 상이한 치료 후, 후속 분석4,5에대한 충분한 품질 및 수량의 mRNAs를 얻을 필요가 있다. DNA와 는 대조적으로, RNA는 고정에 더 민감하고 목적이 RNA를 공부하는 때 동결 조직의 사용은 추천됩니다. mRNA는 유비쿼터스 리보누클러(RNase)에 의해 빠르게 분해되기 때문에 시편 처리 및 준비 중 엄격한 RNase 프리 조건이 필요하며 실온에서 시료를 보관하지 않는 것이 필요합니다. 또한, 어떤 장기간 수성 위상 단계없이 빠른 기술은 RNA 저하를 방지하기 위해 중요하다6. RNA 수율 및 무결성은 또한 LCM 공정 및 LCM 시스템 사용7,8에의해 영향을 받을 수 있다. 현재, 다른 작동 원리를 가진 4개의 LCM 시스템을 사용할 수 있습니다2. RNA 추출 방법은 다른 RNA 격리 키트가 RNA 수량 및 품질7,8에서유의한 차이로 테스트되었기 때문에 중요 할 수 있습니다.
모든 조직 준비 방법은 좋은 형태학적 대비를 얻고 추가 분석을 위한 RNA 무결성을 유지하는 것 사이에서 균형을 찾아야 합니다. 뼈에서 냉동 섹션을 준비하기 위해 접착제 필름이 개발되어지속적으로 개선 9. 뼈 부분은 접착제 필름에 직접 절단되고 염색됩니다. 이 접착제 필름은 많은 유형의 염색에 적용 가능하며 LCM9,10,11,12,13을사용하여 뼈 저온절로부터 관심 있는 세포를 분리하는 데 사용될 수 있습니다. 14. 외과 제거, 포함, 동결, 절단 및 염색을 포함한 모든 단계는 1 시간 이내에 완료 할 수 있습니다. 중요한 것은, 골아세포, 골라선 세포 및 파골세포와 같은 세포는9,10,11, 12,13,14를명확하게 식별할 수 있다. 이 방법은 빠르고 간단하다는 장점이 있습니다. 뼈 저온 절을 생성하는 다른 방법은 테이프 전달시스템(15)을사용하는 것이다. 그러나 후자의 기술은 시간이 더 많이 걸리고 추가계측이 필요하며, 접착 테이프에서 자외선(UV) 가교에 의한 사전 코팅된 멤브레인 슬라이드로 섹션을 옮겨야 하기 때문에 추가적인 계측이 필요합니다. 테이프 전달 시스템은 LCM16, 17,18,19와성공적으로 결합되었지만, 가교 코팅이 배경 패턴을 만들 수 있다는 점에 유의해야 한다. 세포형식별(20)을방해할 수 있다.
전형적으로, 소량의 RNA만이 미세 해부세포로부터 추출되고, RNA의 질 및 양은 종종 마이크로 모세관전기영동21에의해 평가된다. 컴퓨터 프로그램은 RNA 무결성 번호(RIN)라고 하는 RNA 추출물에 품질 지수를 할당하는 데 사용됩니다. RIN 값이 1.0이면 완전히 분해된 RNA를 나타내지만 10.0의 값은 RNA가 완전히 손상되지않은 22임을나타냅니다. 일반적으로 5 이상의 인덱스는 RNA 연구에 충분하다고 간주됩니다. RIN 값이 5.0-10.0인 샘플에서 유전자 발현 패턴은 서로 잘 상관관계가 있는 것으로 보고되었다23. 이 방법의 민감도는 높지만 총 RNA의 50 pg/μL이 검출될 수 있기 때문에 시료의 RNA 농도가 매우 낮으면 품질 평가를 얻기가 매우 어려울 수 있습니다. 따라서, RNA 품질을 평가하기 위해, LCM 후 잔류하는 조직 섹션은 종종 RNA를 추출하는 데 사용되며,슬라이드(24)에버퍼를 피펫팅하여 사용된다.
LCM은 다른 냉동 조직에 광범위하게 사용되었지만 추출 된 RNA의 RIN 값은 거의보고되지 않습니다. 게다가, 마우스 뼈에 있는 RNA를 공부하는 가장 적당한 방법을 명확히 하기 위하여 비교 연구 결과가 없습니다. 본 연구에서, 성인 마우스 대퇴골로부터의 냉동 단면은 고품질 RNA를 얻기 위하여 샘플 준비, LCM 프로토콜 및 RNA 추출을 최적화하기 위하여 이용되었다. 본 프로토콜은 샘플 수집을 위해 중력을 사용하는 LCM 시스템에 특히 최적화되었습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
RNA 질 및 양은 조직 조작, LCM 프로세스 및 RNA 추출과 같은 견본 준비의 모든 단계에서 부정적으로 영향을 받을 수 있습니다. 따라서, 후속 유전자 발현 분석을 위한 충분한 양의 고품질 RNA를 얻기 위해 LCM 프로토콜이 개발되었다.
LCM의 경우 대부분의 실험실에서는 7−8 μm두께의 2섹션을 사용합니다. 두꺼운 섹션은 더 많은 재료를 수확 할 수 있습니다. 그러나, 그들은 ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 우테 자이츠와 니콜 지너가 뛰어난 기술적 도움과 수의사 코어 및 동물 관리 직원에게 도움을 준 것에 대해 감사드립니다.
Materials
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | 63689-25ML-F | |
| Absolute ethanol EMPLURA | Merck Millipore | 8,18,76,01,000 | |
| Adhesive film (LMD film) | Section-Lab | C-FL001 | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer System | Agilent Technologies | ||
| Agilent RNA 6000 Pico Chip Kit | Agilent Technologies | 5067-1513 | |
| Arcturus HistoGene Staining Solution | Applied Biosystems | 12241-05 | |
| Cryofilm fitting tool | Section-Lab | C-FT000 | |
| Cryostat Leica CM 1950 | Leica Biosystems | ||
| glass microscope slides, cut colour frosted orange | VWR Life Science | 631-1559 | |
| Histology tissue molds PVC | MEDITE | 48-6302-00 | |
| LMD7 Laser Mikrodissektion System | Leica Microsystems | ||
| Low profile Microtome Blades Leica DB80 XL | Leica Biosystems | 14035843496 | |
| Nuclease-free water | VWR Life Science | E476-500ML | |
| PET membrane slides 1.4 mircon | Molecular Machines & Industries GmbH | 50102 | |
| RNase Away surface decontaminant | Molecular BioProduct | 7002 | |
| RNeasy Micro Kit | Qiagen | 74004 | |
| Tissue-Tek optimal cutting temperature (OCT) compound | Sakura Finetek | 4583 | |
| Xylene | VWR Life Science | 2,89,73,363 |
References
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