Un protocole de microdissection de capture de laser qui donne l'ARN de haute qualité des os frais-congelés de souris
Summary
Un protocole de microdissection de capture laser (LCM) a été développé pour obtenir une quantité suffisante d’ARN de haute qualité pour l’analyse d’expression génique dans les cellules osseuses. L’étude actuelle se concentre sur les sections de fémur de souris. Cependant, le protocole LCM rapporté ici peut être utilisé pour étudier l’expression des gènes dans les cellules de tout tissu dur.
Abstract
Le rendement et l’intégrité de l’ARN sont décisifs pour l’analyse de l’ARN. Cependant, il est souvent techniquement difficile de maintenir l’intégrité de l’ARN tout au long de la procédure de microdissection de capture laser (LCM) entière. Étant donné que les études lCM fonctionnent avec de faibles quantités de matériel, les préoccupations au sujet des rendements limités de l’ARN sont également importantes. Par conséquent, un protocole de LCM a été développé pour obtenir la quantité suffisante d’ARN de haute qualité pour l’analyse d’expression de gène dans les cellules d’os. L’effet du protocole de coloration, de l’épaisseur des cryosections, de la quantité microdissé de tissu, du kit d’extraction d’ARN, et du système de LCM employé sur le rendement et l’intégrité d’ARN obtenus des cellules d’os microdissés a été évalué. Des sections d’os congelées de huit m d’épaisseur ont été fabriquées à l’aide d’un film adhésif et tachées à l’aide d’un protocole rapide pour une tache lCL commerciale. L’échantillon a été pris en sandwich entre une membrane de polyéthylène téphtalate (PET) et le film adhésif. Un système LCM qui utilise la gravité pour la collecte d’échantillons et une méthode d’extraction de l’ARN à base de colonnes ont été utilisés pour obtenir des ARN de haute qualité de rendement suffisant. L’étude actuelle se concentre sur les sections de fémur de souris. Cependant, le protocole lCM rapporté ici peut être employé pour étudier l’expression in situ de gène dans les cellules de n’importe quel tissu dur dans les conditions physiologiques et les processus de la maladie.
Introduction
Les tissus sont constitués de types de cellules hétérogènes et distribuées spatialement. Différents types de cellules dans un tissu donné peuvent réagir différemment au même signal. Par conséquent, il est essentiel d’être en mesure d’isoler des populations cellulaires spécifiques pour l’évaluation du rôle des différents types de cellules dans des conditions physiologiques et pathologiques. La microdissection de capture au laser (LCM) offre une méthode relativement rapide et précise pour isoler et enlever les cellules spécifiées des tissus complexes1. Les systèmes LCM utilisent la puissance d’un faisceau laser pour séparer les cellules d’intérêt des sections de tissus histologiques sans avoir besoin de traitement enzymatique ou de croissance de la culture. Cela signifie que les cellules sont dans leur habitat tissulaire naturel, et que l’architecture tissulaire, y compris la relation spatiale entre les différentes cellules est conservée. La morphologie des cellules capturées et du tissu résiduel est bien préservée, et plusieurs composants tissulaires peuvent être échantillonnés séquentiellement à partir de la même diapositive. Les cellules isolées peuvent ensuite être utilisées pour l’analyse ultérieure de leur ARN, ADN, protéines ou métabolites2,3.
Afin d’analyser l’expression des gènes dans différentes populations cellulaires, ou après différents traitements, il est nécessaire d’obtenir des ARNm de qualité et de quantité suffisantes pour l’analyse ultérieure4,5. Contrairement à l’ADN, les ARN sont plus sensibles à la fixation et l’utilisation de tissus congelés est recommandée lorsque l’objectif est d’étudier l’ARN. Étant donné que les ARNm sont rapidement dégradées par des ribonucalis omniprésents (RNase), des conditions strictes sans RNase pendant la manipulation et la préparation des échantillons et d’éviter le stockage des échantillons à température ambiante sont nécessaires. En outre, les techniques rapides sans aucune étape aqueuse prolongée de phase sont cruciales pour empêcher la dégradation d’ARN6. Le rendement et l’intégrité de l’ARN peuvent également être affectés par le processus LCM et le système LCM utilisé7,8. Actuellement, quatre systèmes LCM avec des principes d’exploitation différents sont disponibles2. La méthode d’extraction de l’ARN peut également être importante, puisque différents kits d’isolement d’ARN ont été testés avec des différences significatives dans la quantité et la qualité d’ARN7,8.
Toute méthode de préparation des tissus nécessite de trouver un équilibre entre l’obtention d’un bon contraste morphologique et le maintien de l’intégrité de l’ARN pour d’autres analyses. Pour la préparation des sections congelées de l’os, un film adhésif a été développé et continuellement amélioré9. Les sections osseuses sont coupées et tachées directement sur le film adhésif. Ce film adhésif est applicable à de nombreux types de coloration, et peut être utilisé pour isoler les cellules d’intérêt de cryosections osseuses en utilisant LCM9,10,11,12,13, 14. Toutes les étapes, y compris l’ablation chirurgicale, l’intégration, la congélation, la coupe et la coloration peuvent être complétées en moins d’une heure. Fait important, les cellules telles que les ostéoblastes, les cellules de doublure osseuse, et les ostéoclastes peuvent être clairement identifiés9,10,11,12,13,14. Cette méthode a l’avantage d’être rapide et simple. Une autre méthode pour générer des cryosections osseuses est d’utiliser le système de transfert de bande15. Cependant, cette dernière technique prend plus de temps et nécessite une instrumentation supplémentaire, puisque les sections doivent être transférées du ruban adhésif sur des glissières de membrane précouchées par liaison croisée ultraviolette (UV). Bien que le système de transfert de bande a été couplé avec succès avec LCM16,17,18,19, il convient de noter que le revêtement relié transversal peut créer un modèle de fond qui peut interférer avec l’identification de type cellulaire20.
Typiquement, seulement de petites quantités d’ARN sont extraites des cellules microdissés, et la qualité et la quantité d’ARN sont souvent évaluées par électrophorèse micro-capillaire21. Un programme informatique est utilisé pour attribuer un indice de qualité aux extraits d’ARN appelés numéro d’intégrité de l’ARN (RIN). Une valeur RIN de 1,0 indique l’ARN complètement dégradé, tandis qu’une valeur de 10,0 suggère que l’ARN est entièrement intact22. Habituellement, les indices de plus de 5 sont considérés comme suffisants pour les études d’ARN. Des modèles d’expression génique dans des échantillons d’une valeur RIN de 5,0 à 10,0 ont été rapportés en corrélation entreeux 23. Bien que la sensibilité de cette méthode soit élevée, puisque l’on peut détecter à moins de 50 pg/L d’ARN total, il peut être très difficile d’obtenir une évaluation de la qualité si la concentration d’ARN dans l’échantillon est très faible. Par conséquent, afin d’évaluer la qualité de l’ARN, la section tissulaire restante après le LCM est souvent utilisée pour extraire l’ARN, en tampon pipetting sur la diapositive24.
Bien que le LCM ait été largement utilisé sur différents tissus congelés, les valeurs RIN des ARN extraites sont rarement rapportées. En outre, il n’existe pas d’études comparatives pour clarifier la méthode la plus appropriée pour étudier l’ARN dans les os de souris. Dans la présente étude, des sections congelées de fémurs de souris adultes ont été utilisées pour optimiser la préparation de l’échantillon, le protocole LCM et l’extraction de l’ARN afin d’obtenir des ARN de haute qualité. Le protocole actuel a été optimisé en particulier pour le système LCM qui utilise la gravité pour la collecte d’échantillons.
Protocol
Representative Results
Discussion
La qualité et la quantité d’ARN peuvent être affectées négativement à toutes les étapes de la préparation d’échantillon telle que la manipulation de tissu, le processus de LCM, et l’extraction d’ARN. Par conséquent, un protocole de LCM a été développé pour obtenir la quantité suffisante d’ARN de haute qualité pour l’analyse suivante d’expression de gène.
Pour l’AmC, la plupart des laboratoires utilisent des sections de 7 à 8 m d’épaisseur2. Des sections plus épai…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs remercient Ute Zeitz et Nikole Ginner pour leur excellente aide technique ainsi que le Vetcore et le personnel de soins aux animaux pour leur soutien.
Materials
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | 63689-25ML-F | |
| Absolute ethanol EMPLURA | Merck Millipore | 8,18,76,01,000 | |
| Adhesive film (LMD film) | Section-Lab | C-FL001 | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer System | Agilent Technologies | ||
| Agilent RNA 6000 Pico Chip Kit | Agilent Technologies | 5067-1513 | |
| Arcturus HistoGene Staining Solution | Applied Biosystems | 12241-05 | |
| Cryofilm fitting tool | Section-Lab | C-FT000 | |
| Cryostat Leica CM 1950 | Leica Biosystems | ||
| glass microscope slides, cut colour frosted orange | VWR Life Science | 631-1559 | |
| Histology tissue molds PVC | MEDITE | 48-6302-00 | |
| LMD7 Laser Mikrodissektion System | Leica Microsystems | ||
| Low profile Microtome Blades Leica DB80 XL | Leica Biosystems | 14035843496 | |
| Nuclease-free water | VWR Life Science | E476-500ML | |
| PET membrane slides 1.4 mircon | Molecular Machines & Industries GmbH | 50102 | |
| RNase Away surface decontaminant | Molecular BioProduct | 7002 | |
| RNeasy Micro Kit | Qiagen | 74004 | |
| Tissue-Tek optimal cutting temperature (OCT) compound | Sakura Finetek | 4583 | |
| Xylene | VWR Life Science | 2,89,73,363 |
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