Verdunkelung von Riesen-Unilamellar-Hybridvesikeln durch Elektroformation und Messung ihrer mechanischen Eigenschaften durch Micropipette Aspiration
Summary
Ziel des Protokolls ist es, die mechanischen Eigenschaften von Riesenvesikeln durch Mikropipette-Aspiration zuverlässig zu messen.
Abstract
Riesige Vesikel aus Phospholipiden und Copolymeren können in verschiedenen Anwendungen genutzt werden: kontrollierte und gezielte Wirkstoffabgabe, biomolekulare Erkennung innerhalb von Biosensoren zur Diagnose, funktionelle Membranen für künstliche Zellen und Entwicklung bioinspirierter Mikro-/Nanoreaktoren. In all diesen Anwendungen ist die Charakterisierung ihrer Membraneigenschaften von grundlegender Bedeutung. Unter den bestehenden Charakterisierungstechniken ermöglicht die von E. Evans entwickelte Mikropipette-Aspiration die Messung der mechanischen Eigenschaften der Membran wie Flächenkompressiermodul, Biegemodul und Lysespannung und Dehnung. Hier stellen wir alle Methoden und detaillierten Verfahren zur Gewinnung von Riesenbläschen aus dem Dünnschicht eines Lipids oder Copolymers (oder beidem), die Herstellung und Oberflächenbehandlung von Mikropipetten und das Aspirationsverfahren vor, das zur Messung aller zuvor genannten Parameter führt.
Introduction
Riesenbläschen aus Phospholipiden (Liposomen) sind seit den 1970er Jahren als Basis-Zellmembranmodell1weit verbreitet. In den späten 1990er Jahren erschienen vesikuläre Morphologien, die aus der Selbstmontage von Copolymeren gewonnen wurden, polymersomen in Bezug auf ihre Lipidanaloga2,3, schnell als interessante Alternative zu Liposomen, die eine schwache mechanische Stabilität und eine schlechte modulare chemische Funktionalität besitzen. Ihr zellbiomimetischer Charakter ist jedoch im Vergleich zu Liposomen eher begrenzt, da letztere aus Phospholipiden bestehen, dem Hauptbestandteil der Zellmembran. Darüber hinaus kann ihre geringe Membrandurchlässigkeit in einigen Anwendungen wie der Medikamentenabgabe ein Problem sein, bei der eine kontrollierte Diffusion von Arten durch die Membran erforderlich ist. Kürzlich wurde die Verbindung von Phospholipiden mit Blockcopolymeren zur Entwicklung von Hybridpolymer-Lipid-Vesikeln und Membranen Gegenstand einer zunehmenden Anzahl von Studien4,5. Die Hauptidee besteht darin, Einheiten zu entwerfen, die die Vorteile jeder Komponente synergistisch kombinieren (Biofunktionalität und Permeabilität von Lipid-Doppelschichten mit der mechanischen Stabilität und chemischen Vielseitigkeit von Polymermembranen), die in verschiedenen Anwendungen genutzt werden können: kontrollierte und zielgerichtete Wirkstoffabgabe, biomolekulare Erkennung innerhalb von Biosensoren für die Diagnose, funktionelle Membranen für künstliche Zellen, Entwicklung bioinspirierter Mikro-/Nanoreaktoren.
Heutzutage haben verschiedene wissenschaftliche Gemeinschaften (Biochemiker, Chemiker, Biophysiker, Physiker, Biologen) ein wachsendes Interesse an der Entwicklung eines fortschrittlicheren Zellmembranmodells. Hier ist es unser Ziel, so detailliert wie möglich, bestehende Methoden (Elektroformation, Mikropipette-Aspiration) zu präsentieren, um die mechanischen Eigenschaften von Riesenvesikeln und die jüngsten “fortgeschrittenen” Zellmembranmodelle zu erhalten und zu charakterisieren, die Hybridpolymer-Lipid-Riesenbläschen4,5sind.
Der Zweck dieser Methoden ist es, eine zuverlässige Messung der Flächenkompressibilität und Biegemodul i der Membran sowie deren Lysespannung und Dehnung zu erhalten. Eine der gebräuchlichsten Techniken zur Messung der Biegesteifigkeit eines riesigen Vesikels ist die Fluktuationsanalyse6,7, basierend auf direkter Videomikroskopbeobachtung; dies erfordert jedoch eine große sichtbare Membranfluktuation und wird nicht systematisch auf dicken Membranen (z.B. Polymersomen) gewonnen. Der Flächenkompressibilitätsmodul kann experimentell mit der Langmuir Blodgett-Technik bestimmt werden, aber meistens auf einer Monoschicht8. Die Micropipette-Aspirationstechnik ermöglicht die Messung beider Module an einem bilayerbildenden Riesen-Unilamellen-Vesikel (GUV) in einem Experiment.
Die folgende Methode eignet sich für alle amphiphilen Moleküle oder Makromoleküle, die in der Lage sind, Bilayer und damit Vesikel durch Elektroformation zu bilden. Dies erfordert einen flüssigen Charakter der Bilayer bei der Temperatur der Elektroformation.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Beschichtung der Mikropipette ist einer der wichtigsten Punkte, um zuverlässige Messungen zu erhalten. Die Haftung des Vesikels an der Mikropipette muss verhindert werden, und eine Beschichtung wird häufig in der Literatur17,18,19,20,21, mit BSA, ‘-Casein oder Surfasil verwendet. Details des Beschichtungsverfahrens werden selten erwähnt.
<p class="j…Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken dem ANR für die finanzielle Unterstützung (ANR Sysa).
Materials
| Required equipment and materials for micropipette design | |||
| Borosilicate Glass Capillaries | World Precision Instruments | 1B100-4 | external and internal diameter of 1mm and 0.58 mm respectively. |
| Filament installed | Sutter Instrument Co. | FB255B | 2.5mm*2.5mm Box Filament |
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | Model P-97 | |
| Microforge | NARISHGE Co. | MF-900 | fitted with two objectives (10x and 32x) |
| Materials for coating pipette tips with BSA | |||
| Bovine Serum Albumin Fraction V (BSA) | Sigma-Aldrich | 10735078001 | |
| Disposable 1 ml syringe Luer Tip | Codan | 62.1612 | |
| Disposable 10 ml syringe Luer Tip | Codan | 626616 | |
| Disposable 5 ml syringe Luer Tip | Codan | 62.5607 | |
| Disposable acetate cellulose filter | Cluzeau Info Labo | L5003SPA | Pore size: 0.22µm, diameter: 25mm |
| Flexible Fused Silica Capillary Tubing | Polymicro Technologies. | TSP530660 | Inner Diameter 536µm, Outer Diameter 660µm, |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G5767 | |
| Syringe 500 µL luer Lock GASTIGHT | Hamilton Syringe Company | 1750 | |
| Test tube rotatory mixer | Labinco | 28210109 | |
| Micromanipulation Set up | |||
| Aluminum Optical Rail, 1000 mm Length, M4 threads, X48 Series | Newport | ||
| Damped Optical Table | Newport | used as support of microscope to prevent external vibrations. | |
| Micromanipulator | Eppendorf | Patchman NP 2 | The module unit (motor unit for X, Y and Z movement) is mounted on the inverted microscope by the way of an adapter. |
| Micrometer | Mitutoyo Corporation | 350-354-10 | Digimatic LCD Micrometer Head 25,4 mm Range 0,001 mm |
| Plexiglass water reservoir (100 ml) | Home made | ||
| TCS SP5 inverted confocal microscope (DMI6000) equipped with a resonant scanner and a water immersion objective (HCX APO L 40x/0.80 WU-V-I). | Leica | ||
| X48 Rail Carrier 80 mm Length,with 1/4-20, 8-32 and 4-40 thread | Newport | ||
| Materials for sucrose and amphiphile solution preparation | |||
| 2-Oleoyl-1-palmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine | Sigma-Aldrich | ||
| Chloroform | VWR | 22711.244 | |
| L-α-Phosphatidylethanolamine-N-(lissamine rhodamine B sulfonyl) | Sigma-Aldrich | 810146C | Rhodamine tagged lipid |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S7903 | |
| Electroformation set up | |||
| 10 µL glass capillary ringcaps | Hirschmann | 9600110 | |
| Disposable 1 ml syringe Luer Tip | Codan | 62.1612 | |
| H Grease | Apiezon | Apiezon H Grease | Silicon-free grease |
| Indium tin oxide coated glass slides | Sigma-Aldrich | 703184 | |
| Needle | Terumo | AN2138R1 | 0.8 x 38 mm |
| Ohmmeter (Multimeter) | Voltcraft | VC140 | |
| Toluene | VWR | 28676.297 | |
| Voltage generator | Keysight | 33210A |
References
- Bangham, A. D., Standish, M. M., Watkins, J. C. Diffusion of univalent ions across the lamellae of swollen phospholipids. Journal of Molecular Biology. 13 (1), (1965).
- Discher, D. E., Eisenberg, A. Polymer vesicles. Science. 297 (5583), 967-973 (2002).
- Hammer, D., et al. Polymersomes: vesicles from block copolymers. Annals of Biomedical Engineering. 28 (SUPPL. 1), (2000).
- Le Meins, J. F., Schatz, C., Lecommandoux, S., Sandre, O. Hybrid polymer/lipid vesicles: state of the art and future perspectives. Materials Today. 16 (10), 397-402 (2013).
- Schulz, M., Binder, W. H. Mixed Hybrid Lipid/Polymer Vesicles as a Novel Membrane Platform. Macromolecular Rapid Communications. 36, 2031-2041 (2015).
- Schneider, M. B., Jenkins, J. T., Webb, W. W. Thermal fluctuations of large quasi-spherical bimolecular phospholipid vesicles. Journal De Physique. 45 (9), 1457-1472 (1984).
- Dimova, R. Recent developments in the field of bending rigidity measurements on membranes. Advances in Colloid and Interface Science. 208, 225-234 (2014).
- Rodríguez-García, R., et al. Polymersomes: smart vesicles of tunable rigidity and permeability. Soft Matter. 7 (4), 1532-1542 (2011).
- Angelova, M. I., Dimitrov, D. S. Liposome electroformation. Faraday Discussions of the Chemical Society. 81, 303-311 (1986).
- Dao, T. P. T., et al. Membrane properties of giant polymer and lipid vesicles obtained by electroformation and pva gel-assisted hydration methods. Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects. 533, 347-353 (2017).
- Pereno, V., et al. Electroformation of Giant Unilamellar Vesicles on Stainless Steel Electrodes. ACS omega. 2 (3), 994-1002 (2017).
- Evans, E., Rawicz, W. Entropy-driven tension and bending elasticity in condensed-fluid membranes. Physical Review Letters. 64 (17), 2094-2097 (1990).
- Dao, T. P. T., et al. Modulation of phase separation at the micron scale and nanoscale in giant polymer/lipid hybrid unilamellar vesicles (GHUVs). Soft Matter. 13 (3), 627-637 (2017).
- Helfrich, W. Elastic properties of lipid bilayers: theory and possible experiments. Z Naturforsch C. 11 (11), 693-703 (1973).
- Dao, T. P. T., et al. The combination of block copolymers and phospholipids to form giant hybrid unilamellar vesicles (GHUVs) does not systematically lead to "intermediate” membrane properties. Soft Matter. 14 (31), 6476-6484 (2018).
- Shoemaker, S. D., Kyle Vanderlick, T. Material Studies of Lipid Vesicles in the Lα and Lα-Gel Coexistence Regimes. Biophysical Journal. 84 (2), 998-1009 (2003).
- Longo, M. L., Ly, H. V., Dopico, A. M. . Methods in Membrane Lipids. , 421-437 (2007).
- Chen, D., Santore, M. M. Hybrid copolymer-phospholipid vesicles: phase separation resembling mixed phospholipid lamellae, but with mechanical stability and control. Soft Matter. 11 (13), 2617-2626 (2015).
- Mabrouk, E., et al. Formation and material properties of giant liquid crystal polymersomes. Soft Matter. 5, 1870-1878 (2009).
- Henriksen, J., et al. Universal behavior of membranes with sterols. Biophysical Journal. 90 (5), 1639-1649 (2006).
- Ly, H. V., Block, D. E., Longo, M. L. Interfacial Tension Effect of Ethanol on Lipid Bilayer Rigidity, Stability, and Area/Molecule: A Micropipet Aspiration Approach. Langmuir. 18 (23), 8988-8995 (2002).
- Bermudez, H., Hammer, D. A., Discher, D. E. Effect of Bilayer Thickness on Membrane Bending Rigidity. Langmuir. 20, 540-543 (2004).
