造血干细胞(HSPCs)由于血液形成过程中的代谢可塑性,从静止状态过渡到分化状态。在这里,我们提出了一个优化的方法,用于测量线粒体呼吸和HSPCs的糖解。
造血干细胞(HSPCs)具有明显的代谢可塑性,允许它们从静止状态过渡到分化状态,以维持血液形成的需求。然而,由于HSPC数量有限,并且缺乏针对非粘附性、易碎HSPCs的优化方案,因此很难分析HSPC的代谢状态(线粒体呼吸和糖解)。在这里,我们提供一套清晰、分步的指示,以测量代谢呼吸(耗氧率;OCR)和糖解(细胞外酸化率;ECAR) 的鼠骨髓-血统内格Sca1+c-Kit= (LSK) HSPCs。该协议从小鼠骨髓中提供更高量的LSK HSPCs,提高孵育期间HSPCs的生存能力,促进非粘附性HSPCs的细胞外通量分析,并为针对氧化磷酸化和糖解途径的药物提供优化的注射方案(浓度和时间)。该方法能够预测血液发育和疾病期间的代谢状态和HSPCs的健康。
由于大多数成熟血细胞的寿命较短,血液的平衡依赖于长寿但罕见的造血干细胞(HSPCs)1的自我更新和分化。HSPC是静止的,但它们在刺激下迅速增殖和分化,以维持血液系统的需求。由于每个HSPC细胞状态都需要独特的生物能量需求,代谢变化是HSPC命运决定的关键驱动因素。因此,代谢可塑性的损失,通过改变HSPCs的静止、自我更新和分化之间的平衡,往往导致骨髓或淋巴增殖性疾病。总之,对HSPC发育的代谢调节的理解对于发现血液恶性肿瘤2、3、4、5的深层机制至关重要。
线粒体呼吸和糖解产生ATP,以推动细胞内反应,并产生大分子合成所需的构建基块。由于HSPCs与分化细胞6相比线粒体质量较低,并且它们在低氧骨髓利基中维持静止,因此HSPCs主要依靠糖解。HSPCs的激活增强了其线粒体代谢,导致静止的丧失和随后进入细胞周期。HSPC的这种代谢可塑性允许在整个成人寿命6,7,8,9,10,11,12期间维持HSPC池。因此,分析HSPC活化和健康状况,必须研究其代谢活动,如耗氧率(OCR;氧化磷酸化指数)和细胞外酸化率(ECAR;糖解指数)。OCR 和 ECAR 都可以使用细胞外通量分析仪进行实时测量。然而,目前的方法需要大量的细胞,并针对附着细胞13进行了优化。由于HSPC不能从小鼠14中大量分离,需要分拣才能获得纯种群,是非粘附细胞15,并且不能在一夜之间培养,而不避免分化16,因此很难测量HSPC的OCR和ECAR。在这里,我们提供一组清晰的分步说明,以伴随视频教程如何测量代谢呼吸和糖解的几千个小鼠骨髓-血统negSca1+c-Kit+ (LSK) HSPCs。
在这里,我们演示了最大数量的纯和活的鼠LSK HSPCs种群的分离,以及使用细胞外通量分析仪测量其糖解和线粒体呼吸。具体来说,该协议克服了使用LSK HSPCs的下列技术问题:i) LSK HSPCs在小鼠骨髓14中的低频率,ii) LSK HSPCs26的低基础代谢活性,iii) LSK HSPCs27的脆弱;iv) LSK HSPCs 不粘附于培养容器15。此外,我们还优化了药物浓…
The authors have nothing to disclose.
这项工作部分得到了国家卫生研究院(HL131645、CA016058)、圣巴尔德里克基金会和佩洛多尼亚基金会的资助支持。
0.01% (w/v) poly-L-lysine solution | Sigma | P8920 | Used for LSK attachment |
40 µm cell strainer | Fisher Scientific | 22-363-547 | Used for cell filtration after bone crushing |
Anti-Biotin MicroBeads | Miltenyi | 130-090-485 | Used for Lin- separation |
Biotin Rat Anti-Mouse CD45R/B220 Clone RA3-6B2 | BD Biosciences | 553086 | Used for Lin- separation |
Biotin Rat Anti-Mouse CD5 Clone 53-7.3 | BD Biosciences | 553019 | Used for Lin- separation |
Biotin Rat Anti-Mouse CD8a Clone 53-6.7 | BD Biosciences | 553029 | Used for Lin- separation |
Biotin Rat Anti-Mouse Ly-6G and Ly-6C Clone RB6-8C5 | BD Biosciences | 553125 | Used for Lin- separation |
Biotin Rat Anti-Mouse TER-119/Erythroid Cells Clone TER-119 | BD Biosciences | 553672 | Used for Lin- separation |
CD117 (c-Kit) Monoclonal Antibody (2B8), APC | eBioscience | 17-1171-83 | Used for LSK sorting |
Falcon 15 ml Conical Centrifuge Tubes | Falcon-Fischer Scientific | 14-959-53A | Used in cell isolation |
Falcon 50 ml Conical Centrifuge Tubes | Falcon-Fischer Scientific | 14-432-22 | Used in cell isolation |
Falcon Round-Bottom Polypropylene Tubes | Falcon-Fischer Scientific | 14-959-11A | Used for LSK sorting |
Fetal Bovine Serum | Neuromics | FBS001-HI | Used in FACS buffer |
Histopaque-1083 | Sigma | 10831 | Used for ficoll gradient separation |
L-glutamine 100x | Fisher Scientific | 25-030-081 | Used for the assay media |
LS Column | Miltenyi | 130-042-401 | Used for Lin- separation |
Ly-6A/E (Sca-1) Monoclonal Antibody (D7), PE-Cyanine7 | eBioscience | 25-5981-82 | Used for LSK sorting |
Murine Stem Cell Factor (SCF) | PeproTech | 250-03-100UG | Used for the assay media |
Murine Thrombopoietin (TPO) | PeproTech | 315-14-100UG | Used for the assay media |
PBS 1% | Fisher Scientific | SH3002802 | Used for FACS buffer |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Fisher Scientific | 15140122 | Used for the assay media |
Propidium Iodide | Fisher Scientific | P1304MP | Used for LSK sorting |
Seahorse XFp Cell Culture Miniplate | Agilent Technologies | 103025-100 | Used for LSK seeding |
Sodium Pyruvate (100 mM) | ThermoFisher | 11360070 | Used for the assay media |
Streptavidin eFluor 450 Conjugate | eBioscience | 48-4317-82 | Used for LSK sorting |
XF Calibrant | Agilent Technologies | 100840-000 | Used for cartridge equilibration |
XF media | Agilent Technologies | 103575-100 | Used for the assay media |
XFp Glycolysis Stress Test Kit | Agilent Technologies | 103017100 | Drugs for glycolysis stress test |
XFp Mitochondrial Stress Test Kit | Agilent Technologies | 103010100 | Drugs for mitochondrial stress test |
XFp Sensor Cartridge | Agilent Technologies | 103022-100 | Used for glycolysis and mitochondrial stress test |